골수 증식 종양의 전달-이식 마우스 모델
Summary
This manuscript provides a description of the methodology used to establish transduction-transplantation mouse models. A detailed account is given of technical errors to avoid when performing bone marrow transplants. A clear understanding should be gained of the importance of high viral titer, transfection/transduction, and irradiation.
Abstract
Transduction-transplantation is a quick and efficient way to model human hematologic malignancies in mice. This technique results in expression of the gene of interest in hematopoietic cells and can be used to study the gene’s role in normal and/or malignant hematopoiesis. This protocol provides a detailed description on how to perform transduction-transplantation using calreticulin (CALR) mutations recently identified in myeloproliferative neoplasm (MPN) as an example. In this protocol whole bone marrow cells from 5-flurouracil (5-FU) treated donor mice are transduced with a retrovirus encoding mutant CALR and transplanted into lethally irradiated syngeneic hosts. Donor cells expressing mutant CALR are marked with green fluorescent protein (GFP). Transplanted mice develop an MPN phenotype including elevated platelets in the peripheral blood, expansion of megakaryocytes in the bone marrow, and bone marrow fibrosis. We provide a step-by-step account of how to generate retrovirus, calculate viral titer, transduce whole bone marrow cells, and transplant into irradiated recipient mice.
Introduction
전달-이식 생쥐에서 혈액 악성 종양을 모델링하는 유용한 방법이다. 이 기술은 다시 BCR-ABL1의 이소성 표현이 충실 마우스 (1) 만성 골수성 백혈병을 요점을 되풀이 수있는 최초의 시범 데이트 골수의 악성 종양을 공부에 특히 가치가있다. 이 기술은 이후에 골수 증식 성 신 생물 (MPN)에 돌연변이 JAK2 V617F 및 MPL W515K / L의 광범위한 연구를 촉진하고있다.
MPN 성숙한 골수 세포 및 골수 섬유증의 과잉 특징 혈액 종양의 그룹이다. 이 질환은 일반적으로 릴화 Jak2, MPL, 또는 CALR 하나의 체세포 돌연변이를 획득 한 조혈 줄기 세포의 클론 확장에서 발생한다. 전달 이식 JAK2 V617F 및 MPL W515K / L 모델 전시 진성 다혈 구증 및 골수 섬유증 (2)의 임상 적 특징 – 5 </ SUP>. 최근, 칼레 티 큘린 돌연변이 MPN의 마우스 모델은 또한 전달 이식 방법 (6)로 생성되었다. 이러한 마우스는 증가 된 혈소판, 거핵구 증가 수, 골수 섬유증 필수적인 혈소판과 같은 질환을 개발한다. 함께, 이러한 모델은 MPN의 분자 기전에 대한 통찰력을 얻을 수있는 기회뿐만 아니라, 개발 및 전임상 설정에서 치료제를 연구 할 수있는 능력을 제공하고 있습니다뿐만 아닙니다.
이 원고는 CALRdel52 돌연변이에 초점을 전달 이식 방법에 대한 자세한 설명을 제공합니다. 이 기술은 조사 된 동계 돌연변이받는 마우스로 구성 retrovirally 형질 발현하는 골수 세포의 이식을 포함한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜은 질병의 드라이버로 CALRdel52 변이 골수 섬유증으로 진행과 필수적인 혈소판 같은 질환 요점을 되풀이하는 생쥐 골수 이식을 수행하는 방법에 대한 상세한 설명을 제공한다. 혈소판 증가, 거핵 세포의 확장 및 골수 섬유증에 CALRdel52 결과를 발현하는 세포의 이식에 성공. 골수 이식은 다단계 과정이기 때문에 기술적 오류 관심 또는 마우스 사망의 유전자를 발현하는 세포의 생착 불량?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work is supported by the V Foundation Scholar (AGF) and the MPN Research Foundation (AGF).
Materials
| CELL LINES | |||
| DMEM | Corning | MT-10-013-CV | |
| 293T cells | ATCC | CRL-11268 | |
| 3T3 cells | ATCC | CRL-1658 | |
| PLASMIDS | |||
| EcoPak, also known as pCL-Eco | Addgene | 12371 | Retroviral packaging cell lines, such as EcoPack 2-293, may be used in place of the EcoPak plasmid and standard 293T cells. Additional γ-retrovirus envelope and packaging plasmids are available from Addgene and others. |
| MSCV-IRES-GFP (MIG) | Addgene | 20672 | Additional γ-retroviral transfer plasmids are available from Addgene and others. |
| CONSUMABLES | |||
| 27G x 1/2" needles | BD | 305620 | |
| Fetal bovine serum | Corning | MT-35-010-CV | |
| Penicillin/streptomycin/L-glutamine | Corning | MT-30-009-CI | |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Corning | MT-25-052-CI | Can be homemade |
| PBS | Corning | MT-21-031-CV | |
| 10cm dishes | Fisher | 172931 | |
| 15 ml conical tubes | Fisher | 12565268 | |
| 60mm dishes | Fisher | 150288 | |
| Polybrene | Fisher | NC9840454 | |
| 5-FU | Fisher | A13456-06 | |
| 100um cell strainers | Fisher | 22363549 | |
| 50 ml conical tubes | Fisher | 12565270 | |
| 6-well plate | Fisher | 130184 | |
| FACS tubes | Fisher | 14-959-5 | |
| 0.45um syringe filters | Fisher | 0974061B | |
| Opti-MEM | Gibco | 31985-070 | |
| ACK buffer | Lonza | 10-548E | Can be homemade |
| Recombinant murine IL-3 | Peprotech | 213-13 | |
| Recombinant murine IL-6 | Peprotech | 216-16 | |
| Recombinant murine SCF | Peprotech | 250-03 | |
| X-tremeGENE 9 | Roche | 6365809001 | Transfection reagent |
| 1.5 ml centrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5500 | |
| EQUIPMENT | |||
| BD Accuri C6 | |||
| X-ray irradiator |
Referenzen
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