This manuscript provides a description of the methodology used to establish transduction-transplantation mouse models. A detailed account is given of technical errors to avoid when performing bone marrow transplants. A clear understanding should be gained of the importance of high viral titer, transfection/transduction, and irradiation.
Transduction-transplantation is a quick and efficient way to model human hematologic malignancies in mice. This technique results in expression of the gene of interest in hematopoietic cells and can be used to study the gene’s role in normal and/or malignant hematopoiesis. This protocol provides a detailed description on how to perform transduction-transplantation using calreticulin (CALR) mutations recently identified in myeloproliferative neoplasm (MPN) as an example. In this protocol whole bone marrow cells from 5-flurouracil (5-FU) treated donor mice are transduced with a retrovirus encoding mutant CALR and transplanted into lethally irradiated syngeneic hosts. Donor cells expressing mutant CALR are marked with green fluorescent protein (GFP). Transplanted mice develop an MPN phenotype including elevated platelets in the peripheral blood, expansion of megakaryocytes in the bone marrow, and bone marrow fibrosis. We provide a step-by-step account of how to generate retrovirus, calculate viral titer, transduce whole bone marrow cells, and transplant into irradiated recipient mice.
Transducción-trasplante es un método útil para modelar neoplasias hematológicas en ratones. Esta técnica ha sido particularmente valiosa para el estudio de las neoplasias mieloides que se remontan a la primera demostración de que la expresión ectópica de BCR-ABL1 podría recapitular fielmente la leucemia mielógena crónica en ratones 1. Esta técnica ha facilitado posteriormente el amplio estudio de JAK2 V617F y MPL W515K / L mutado neoplasias mieloproliferativas (MPN).
NMP son un grupo de neoplasias malignas hematológicas caracterizadas por la sobreproducción de células mieloides maduras y fibrosis de la médula ósea. Estas enfermedades generalmente surgen de la expansión clonal de una célula madre hematopoyética que ha adquirido una mutación somática en cualquiera Jak2, MPL, o CALR. Transducción-trasplante de JAK2 V617F y MPL W515K modelos / L presentan las características clínicas de la policitemia vera y mielofibrosis 2 – 5 </ Sup>. Recientemente, un modelo de ratón de la MPN calreticulin mutado también ha sido generado con el método de la transducción-trasplante 6. Estos ratones desarrollan una enfermedad esencial trombocitemia-como con el aumento de las plaquetas, aumento del número de megacariocitos, y fibrosis de médula ósea. En conjunto, estos modelos no sólo han proporcionado la oportunidad de conocer mejor la patogénesis molecular del MPN, sino también la capacidad para desarrollar y estudiar la terapéutica en un entorno preclínico.
Este manuscrito ofrece una descripción detallada de la metodología de la transducción-trasplante con un enfoque en la mutación CALRdel52. Esta técnica implica el trasplante de células de médula ósea transducidas con retrovirus que expresan el mutante constructo en ratones receptores singénicos irradiados.
Este protocolo proporciona una descripción detallada de cómo llevar a cabo trasplantes de médula ósea en ratones recapitular una enfermedad esencial trombocitemia-como con la progresión de la mielofibrosis con CALRdel52 mutación como el conductor de la enfermedad. el éxito del trasplante de células que expresan los resultados CALRdel52 en un aumento de las plaquetas, la expansión de megacariocitos, y fibrosis de la médula ósea. A medida que el trasplante de médula ósea es un proceso de varios pasos, es impo…
The authors have nothing to disclose.
This work is supported by the V Foundation Scholar (AGF) and the MPN Research Foundation (AGF).
CELL LINES | |||
DMEM | Corning | MT-10-013-CV | |
293T cells | ATCC | CRL-11268 | |
3T3 cells | ATCC | CRL-1658 | |
PLASMIDS | |||
EcoPak, also known as pCL-Eco | Addgene | 12371 | Retroviral packaging cell lines, such as EcoPack 2-293, may be used in place of the EcoPak plasmid and standard 293T cells. Additional γ-retrovirus envelope and packaging plasmids are available from Addgene and others. |
MSCV-IRES-GFP (MIG) | Addgene | 20672 | Additional γ-retroviral transfer plasmids are available from Addgene and others. |
CONSUMABLES | |||
27G x 1/2" needles | BD | 305620 | |
Fetal bovine serum | Corning | MT-35-010-CV | |
Penicillin/streptomycin/L-glutamine | Corning | MT-30-009-CI | |
Trypsin-EDTA (0.05%) | Corning | MT-25-052-CI | Can be homemade |
PBS | Corning | MT-21-031-CV | |
10cm dishes | Fisher | 172931 | |
15 ml conical tubes | Fisher | 12565268 | |
60mm dishes | Fisher | 150288 | |
Polybrene | Fisher | NC9840454 | |
5-FU | Fisher | A13456-06 | |
100um cell strainers | Fisher | 22363549 | |
50 ml conical tubes | Fisher | 12565270 | |
6-well plate | Fisher | 130184 | |
FACS tubes | Fisher | 14-959-5 | |
0.45um syringe filters | Fisher | 0974061B | |
Opti-MEM | Gibco | 31985-070 | |
ACK buffer | Lonza | 10-548E | Can be homemade |
Recombinant murine IL-3 | Peprotech | 213-13 | |
Recombinant murine IL-6 | Peprotech | 216-16 | |
Recombinant murine SCF | Peprotech | 250-03 | |
X-tremeGENE 9 | Roche | 6365809001 | Transfection reagent |
1.5 ml centrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5500 | |
EQUIPMENT | |||
BD Accuri C6 | |||
X-ray irradiator |