Metodi per studiare lipidiche Alterazioni nei neutrofili e la formazione successiva di neutrofili extracellulare Traps

Summary

I lipidi sono noti per svolgere un ruolo importante nelle funzioni cellulari. Qui, si descrive un metodo per determinare la composizione lipidica di neutrofili, con enfasi sul livello di colesterolo, utilizzando sia HPTLC e HPLC per ottenere una migliore comprensione dei meccanismi alla base di neutrofili extracellulare formazione trappola.

Abstract

analisi dei lipidi eseguita da cromatografia su strato sottile ad alta prestazione (HPTLC) è un metodo relativamente semplice e conveniente di analizzare una vasta gamma di lipidi. La funzione dei lipidi (ad esempio, nelle interazioni ospite-patogeno o voce host) è stato segnalato per svolgere un ruolo cruciale nei processi cellulari. Qui mostriamo un metodo per determinare la composizione dei lipidi, con una particolare attenzione per il livello di colesterolo neutrofili emoderivati ​​primari, da HPTLC rispetto a cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC). L'obiettivo era quello di indagare il ruolo delle alterazioni dei lipidi / colesterolo nella formazione di neutrofili trappole extracellulari (NET). rilascio NET è noto come un meccanismo di difesa dell'ospite per impedire la diffusione di agenti patogeni all'interno dell'ospite. Pertanto, neutrofili umani derivati ​​dal sangue sono stati trattati con metil-β-ciclodestrina (MβCD) per indurre alterazioni lipidiche nelle cellule. Utilizzando HPTLC e HPLC, abbiamo dimostrato che il trattamento MβCD delle cellule porta alla lipidicaalterazioni associate con una significativa riduzione del contenuto di colesterolo della cella. Allo stesso tempo, il trattamento MβCD dei neutrofili ha portato alla formazione di reti, come dimostrato da immunofluorescenza. In sintesi, qui vi presentiamo un metodo dettagliato per studiare alterazioni lipidiche neutrofili e la formazione di reti.

Introduction

I lipidi hanno dimostrato di svolgere un ruolo importante nella omeostasi cellulare, morte cellulare, interazioni ospite-patogeno, e di citochine rilascio ^1. Nel corso del tempo, l'interesse e la conoscenza sull'impatto dei lipidi nelle interazioni ospite-patogeno o infiammazioni sono aumentati, e diverse pubblicazioni confermano il ruolo centrale di alcuni lipidi, in particolare il colesterolo di steroidi, in risposte cellulari. trattamento farmacologico con statine, che vengono utilizzati come inibitori della biosintesi del colesterolo bloccando 3-idrossi-3-metilglutaril-Coenzima-A-reduttasi (HMG-CoA reduttasi), può agire come agenti anti-infiammatori abbassando i livelli sierici di interleuchina 6 e proteina C-reattiva ^2. Colesterolo e strutture glicosfingolipidi arricchiti possono essere usate da diversi agenti patogeni, come batteri e virus, come un gateway nell'ospite ^{3, 4, 5,}class = "xref"> 6. Sfingolipidi (ad esempio, sfingomielina) hanno dimostrato di essere utilizzati da patogeni per promuovere la loro patogenicità ^7. Nei macrofagi, domini per entrare nelle cellule uso micobatteri colesterolo arricchita; una deplezione di colesterolo inibisce l'assorbimento micobatterica ^8. Inoltre, infezione di macrofagi con Francisella tularensis, un agente zoonotico responsabile tularemia (noto anche come febbre dei conigli) ^9, ha portato ad un'infezione che è stata abolita quando il colesterolo è stata esaurita dalle membrane ^10. Analogamente, l'invasione delle cellule ospiti di Escherichia coli tramite strutture ricche di lipidi è stata dimostrata per essere il colesterolo-dipendente ^4. Inoltre, Salmonella typhimurium esperimenti di infezione di cellule epiteliali hanno dimostrato che il colesterolo è essenziale per l'ingresso del patogeno nelle cellule ^11. Colesterolo esaurimento inhibited l'assorbimento di Salmonella ^11. Inoltre, un recente studio condotto da Gilk et al. ha dimostrato che il colesterolo svolge un ruolo importante nella diffusione di Coxiella burnetti ^12. Inoltre, Tuong et al. rilevato che il 25-idrossicolesterolo gioca un ruolo cruciale nella fagocitosi da lipopolisaccaride (LPS) -stimulated macrofagi ^13. La fagocitosi è stato ridotto quando i macrofagi sono stati trattati farmacologicamente per esaurire il colesterolo ^14. Così, il colesterolo e altri lipidi sembrano giocare un ruolo importante nella infezione e infiammazione, dal momento che il loro esaurimento può ridurre il rischio di invasione da diversi agenti patogeni ^{10, 11, 12.}

Recentemente, siamo stati in grado di dimostrare che alterazioni lipidiche, in particolare l'esaurimento del colesterolo dalla cella, indurre la formazione di spazio extracellulare neutrofilir trappole (NET) in derivati dal sangue umano neutrofili ^15. Dalla scoperta del NET nel 2004, essi hanno dimostrato di giocare un ruolo critico nel intrappolamento batterica, e quindi nel ostacolare la diffusione di infezioni ^{16, 17.} NET consistono di una dorsale DNA associato con istoni, proteasi, e peptidi antimicrobici ^16. Il rilascio delle reti da neutrofili può essere indotta da patogeni invasori ^{18, 19} e sostanze chimiche come forbolo miristato-acetato (PMA) o statine ^{16, 20.} Tuttavia, i meccanismi cellulari dettagliati e in particolare il ruolo dei lipidi in questo processo, non sono ancora del tutto chiaro. L'analisi dei lipidi può portare ad una migliore comprensione dei meccanismi coinvolti in una varietà di processi e interazioni cellulari, come ad esempio il rilascio di NET. Cholesterol e sfingomielina sono costituenti fondamentali della membrana cellulare e lipidi microdomini, dove si aggiungono la stabilità e facilitare il raggruppamento delle proteine coinvolte nel traffico di proteine e gli eventi ²¹ di segnalazione. Per studiare il ruolo meccanicistico di alcuni lipidi, agenti farmacologici anfifilici, come il ciclico oligosaccaride metil-β-ciclodestrina (MβCD), può essere utilizzato per modificare la composizione lipidica di una cella e per ridurre il colesterolo in vitro ^15. Qui vi presentiamo un metodo per utilizzare HPTLC per analizzare la composizione lipidica dei neutrofili in risposta a MβCD. HPLC è stata utilizzata per confermare il livello di colesterolo nella popolazione dei neutrofili. Inoltre, si descrive un metodo per visualizzare la formazione di NET mediante immunofluorescenza microscopia in neutrofili derivati ​​dal sangue umano in risposta a MβCD.

Protocol

La raccolta di sangue periferico in questo protocollo è stato approvato dalla commissione etica della ricerca umane locale. Tutti i soggetti umani, purché il loro consenso informato scritto. 1. Isolamento dei neutrofili Sangue umano-derivate dal gradiente di densità centrifugazione Isolamento di neutrofili derivati dal sangue umano Strato ~ 20 ml di sangue su 20 mL di sodio diatrizoato / soluzione destrano vicino a una fiamma e senza mescolare. <l…

Representative Results

Neutrofili derivati dal sangue umano sono state isolate mediante centrifugazione a gradiente di densità (Figura 2). Per studiare l'effetto di alterazioni lipidiche sui neutrofili, le cellule sono state trattate con 10 mM MβCD, che esaurisce colesterolo dalla cella. Successivamente, i lipidi sono stati isolati dai campioni di Bligh e Dyer (figura 1, pannello di sinistra), come descritto da Brogden et al. 23. I campio…

Discussion

I metodi qui descritti possono essere utilizzati per analizzare specifici lipidi, come il colesterolo, per HPTLC o HPLC e per studiare gli effetti delle alterazioni lipidiche farmacologici sulla formazione di reti (vedi Neumann et al. ^15).

HPTLC è un metodo relativamente economico e semplice per analizzare una vasta gamma di lipidi in un gran numero di campioni. Questo metodo è stato utilizzato in molte aree di ricerca, compresa la quantificazione antibioti…

Materials

Neutrophil isolation, NET staining and quantification
Alexa Flour 633 goat anti-rabbit IgG	Invitrogen	A-21070
Anti-MPOα antibody	Dako	A0398
BSA	Sigma-Aldrich	3912-100G
Marienfeld-Neubauer improved counting chamber	Celeromics	MF-0640010
Confocal microscope TCS SP5 AOBS with tandem scanner	Leica	DMI6000CS
Dulbecco´s PBS 10X	Sigma-Aldrich	P5493-1L	Dilute 1:10 in water for 1X working solution
Dy Light 488 conjugated highly cross-absorbed	Thermo Fisher Scientific	35503
Excel	Microsoft	2010
DNA/Histone 1 antibody	Millipore	MAB3864
Image J	NIH	1.8	http://imagej.nih.gov/ij/
Light microscope	VWR	630-1554
Methyl-β-cyclodextrin	Sigma-Aldrich	C4555-1G
PFA	Carl Roth	0335.3	dissolve in water, heat up to 65 °C and add 1N NaOH to clear solution
PMA	Sigma-Aldrich	P8139-1MG	Stock 16 µM, dissolved in 1X PBS
Poly-L-lysine	Sigma-Aldrich	P4707
Polymorphprep	AXIS-SHIELD	AN1114683
ProLong Gold antifade reagent with DAPI	Invitrogen	P7481
Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent	Invitrogen	P7581
RPMI1640	PAA	E 15-848
HBSS with CaCl and Mg	Sigma	H6648
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787-50ml
Trypanblue	Invitrogen	15250-061	0.4% solution
Water	Carl Roth	3255.1	endotoxin-free
Name	Company	Catalog Number	Comments
Lipid isolation and analysis
1-propanol	Sigma-Aldrich	33538
10 µl syringe	Hamilton	701 NR 10 µl
Diethyl ether	Sigma-Aldrich	346136
Ethyl acetate	Carl Roth	7336.2
Canullla 26G	Braun	4657683
Copper(II)sulphatepentahydrate	Merck	1027805000
Chloroform	Carl Roth	7331.1
CP ATLAS software	Lazarsoftware	2.0
Chromolith HighResolution RP-18 endcapped 100-4.6 mm column	Merck	152022
High Performance Liquid Chromatograph Chromaster	Hitachi	HITA 892-0080-30Y	Paramaters are dependent on individual HPLC machine
HPLC UV Detector	Hitachi	5410
HPLC Column Oven	Hitachi	5310
HPLC Auto Sampler	Hitachi	5260
HPLC Pump	Hitachi	5160
Methanol	Carl Roth	7342.1
n-Hexane	Carl Roth	7339.1
Phosphoric acid	Sigma-Aldrich	30417
Potassium chloride	Merck	49,361,000
Potters	LAT Garbsen	5 ml
SDS	Carl Roth	CN30.3
HPTLC silica gel 60	Merck	105553
Vacufuge plus basic device	Eppendorf	22820001
Corning Costar cell culture 48-well plate, flat bottom	Sigma	CLS3548
Coverslip	Thermo Fisher Scientific	1198882
Glass slide	Carl Roth	1879
BD Tuberculin Syringe Only 1 ml	BD Bioscience	309659