방법은 지질 호중구의 변경 및 호중구 세포 외 트랩의 후속 형성을 연구하기 위해
Summary
지질은 세포 기능에 중요한 역할을하는 것으로 알려져있다. 여기, 우리는 호중구 세포 트랩 형성의 기본 메커니즘의 더 나은 이해를 얻기 위해 HPTLC 및 HPLC를 모두 사용하여, 콜레스테롤 수준에 중점을두고, 호중구의 지질 구성을 결정하는 방법을 설명합니다.
Abstract
고성능 박층 크로마토 그래피 (HPTLC)에 의해 수행 지질 지질 분석은 다양한 분석을 비교적 간단하고 비용 효율적인 방법이다. (호스트 병원체 상호 작용 또는 호스트 항목에서 예를 들면) 지질의 기능은 세포 과정에 중요한 역할을하는 것으로보고되고있다. 여기서, 우리는 고성능 액체 크로마토 그래피 (HPLC)와 비교하여 기본 HPTLC 혈액 유래 호중구의 콜레스테롤 수준에 초점 지질 조성의 결정 방법을 도시한다. 목표는 호중구 세포 트랩 (그물)의 형성에 지질 / 콜레스테롤 변화의 역할을 알아보고자 하였다. NET 해제는 호스트 내에 병원균 확산을 방지하기 위해 호스트 방어 메커니즘으로 알려져있다. 따라서, 혈액 유래의 인간 호중구 세포 지질 변형을 유도 메틸 β – 시클로 덱스트린 (MβCD)으로 처리 하였다. HPTLC 및 HPLC를 사용하여, 우리는 세포의 MβCD 처리가 지질에 이르게하는 것으로 나타났습니다셀의 콜레스테롤 함량의 상당한 감소와 관련된 변경. 면역 형광 현미경 같이 동시에, 호중구의 MβCD 처리, 그물의 형성되었다. 요약하면, 우리가 지질 호중구의 변경 및 그물의 형성을 연구하는 구체적인 방법을 제시한다.
Introduction
지질은 세포의 항상성, 세포 사멸, 호스트 병원체 상호 작용 및 사이토 카인 릴리스 1에 중요한 역할을하는 것으로 나타났다. 시간이 지남에 따라, 호스트 병원체 상호 작용이나 염증 지질의 영향에 대한 관심과 지식이 증가하고, 여러 출판물 세포 반응의 특정 지질의 중심 역할, 특히 스테로이드 콜레스테롤을 확인합니다. 3- 히드 록시 -3- 메틸 – 조효소-A 환원을 차단하여 콜레스테롤 생합성 억제제로 사용되는 스타틴과 약리 치료 (HMG-CoA를 환원)은 인터류킨의 혈중 농도를 낮춤으로써 같은 항염증제를 작동 할 도 6 및 C 반응성 단백질 2. 및 콜레스테롤 – 글리 풍부한 구조는 호스트 (3), (4), (5)에 대한 게이트웨이로서, 세균 및 바이러스와 같은 여러 병원체에 의해 사용될 수있다클래스 = "외부 참조"> 6. (예를 들어, 스 핑고 마이 엘린)가 도시되어 스핑 고리 피드는 병원성 7을 촉진하는 병원균에 의해 사용된다. 대 식세포에서 마이코 박테리아의 사용 세포를 입력하는 도메인을 콜레스테롤이 풍부한; 콜레스테롤의 고갈은 마이코 박테리아 흡수 8을 억제한다. 또한, Francisella 야토 (또한 토끼 열이라고도 함) 야토 병을 담당하는 동물 매개 제 (9)와 대 식세포가 감염 콜레스테롤 멤브레인 (10)로부터 고갈 될 때 폐지되었다 감염되었다. 유사하게, 지질 과다 구조를 통해 대장균에 의한 숙주 세포의 침윤 콜레스테롤 의존 4 것으로 입증되었다. 또한, 상피 세포의 살모넬라 균 감염 실험 콜레스테롤은 세포 (11)에 병원균 항목에 대한 필수적이라는 것을 보여 주었다. 콜레스테롤 고갈 inhibite살모넬라 (11)의 D 섭취. 또한, Gilk 등의 등의 최근 연구. 콜레스테롤은 Coxiella의 burnetti (12)의 흡수에 중요한 역할을한다는 것을 보여 주었다. 또한, 투옹 등. 25 hydroxycholesterol은 리포 폴리 사카 라이드 (LPS)에 의한 식세포 작용에 중요한 역할을한다는 것을 발견 식세포 (13) 전혈. 대 식세포는 약리학 콜레스테롤 (14)을 고갈 처리했을 때 식균 작용이 감소되었다. 따라서, 콜레스테롤 등의 지질은 고갈 여러 병원균 10, 11, 12에서 침략의 위험을 줄일 수 있기 때문에, 감염과 염증에 중요한 역할을 할 것으로 보인다.
최근에, 우리는 호중구 extracellula의 형성, 즉 지질 변화, 세포에서 콜레스테롤 특히 고갈을 보여 유도 할 수 있었다인간 혈액 유래 호중구 15 R 트랩 (네트). 2004 년에 그물의 발견 때문에, 세균 함정 수사에 중요한 역할을하는 것으로, 따라서 감염 (16), (17)의 확산을 방해에있다. 그물 히스톤, 프로테아제, 및 항균 펩타이드 16와 연관된 DNA 골격 구성. 호중구 그물의 릴리스는 예컨대 포르 볼 미리 스테이트 아세테이트 (PMA) 또는 스타틴 16, 20와 같은 병원균 (18, 19) 및 화학 물질이 침입하여 유도 될 수있다. 그러나, 자세한 세포 메커니즘과이 과정에서 지질 특히 역할은 아직 완전히 명확하지 않다. 지질의 분석은 그물의 출시로 세포 프로세스와 상호 작용의 다양한에 관여하는 메커니즘을 더 잘 이해 될 수 있습니다. CholesteROL과 스 핑고 마이 엘린은 안정성을 추가하고 단백질 인신 매매 및 이벤트 (21) 신호 전달에 관여하는 단백질의 클러스터링을 촉진 세포막과 지질 마이크로 도메인의 중요한 구성 요소입니다. 이러한 환상 올리고당 메틸 β – 시클로 덱스트린 (MβCD)과 같은 특정 지질 양친되는 약물의 기전 역할을 조사하기 위해, 세포의 지질 성분을 변경하고, 시험관 (15) 콜레스테롤을 감소 시키는데 사용될 수있다. 여기서는 MβCD에 응답 호중구의 지질 조성 분석 HPTLC를 사용하는 방법을 제시한다. HPLC는 호중구 인구 콜레스테롤의 수준을 확인하는 데 사용되었다. 더욱이, 우리는 MβCD에 응답하여 인간 혈액 유래 호중구 면역 형광 현미경으로 그물의 형성을 시각화하는 방법을 설명한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 설명 된 방법은 HPTLC 또는 HPLC에 의해 콜레스테롤과 같은 특정 지질을 분석하고, 네트의 형성에 약리 지질 변화의 영향을 조사하는데 사용될 수있다 (노이만 등. 15 참조).
HPTLC 샘플의 다수의 지질의 광범위한 분석을 비교적 비용 효과적인 간단한 방법이다. 이 방법은 항생제 정량화 25, 리소좀 저장 질환 26 지…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 아리안 뉴만에게 제공 수의학, 하노버, 독일의 대학의 "동물 및 인수 공통 감염의"아카데미에 대 한 Tiergesundheit (AFT) 및 박사 과정에서 친교의 친교에 의해 지원되었다.
Materials
| Neutrophil isolation, NET staining and quantification | |||
| Alexa Flour 633 goat anti-rabbit IgG | Invitrogen | A-21070 | |
| Anti-MPOα antibody | Dako | A0398 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | 3912-100G | |
| Marienfeld-Neubauer improved counting chamber | Celeromics | MF-0640010 | |
| Confocal microscope TCS SP5 AOBS with tandem scanner | Leica | DMI6000CS | |
| Dulbecco´s PBS 10X | Sigma-Aldrich | P5493-1L | Dilute 1:10 in water for 1X working solution |
| Dy Light 488 conjugated highly cross-absorbed | Thermo Fisher Scientific | 35503 | |
| Excel | Microsoft | 2010 | |
| DNA/Histone 1 antibody | Millipore | MAB3864 | |
| Image J | NIH | 1.8 | http://imagej.nih.gov/ij/ |
| Light microscope | VWR | 630-1554 | |
| Methyl-β-cyclodextrin | Sigma-Aldrich | C4555-1G | |
| PFA | Carl Roth | 0335.3 | dissolve in water, heat up to 65 °C and add 1N NaOH to clear solution |
| PMA | Sigma-Aldrich | P8139-1MG | Stock 16 µM, dissolved in 1X PBS |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P4707 | |
| Polymorphprep | AXIS-SHIELD | AN1114683 | |
| ProLong Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P7481 | |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent | Invitrogen | P7581 | |
| RPMI1640 | PAA | E 15-848 | |
| HBSS with CaCl and Mg | Sigma | H6648 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-50ml | |
| Trypanblue | Invitrogen | 15250-061 | 0.4% solution |
| Water | Carl Roth | 3255.1 | endotoxin-free |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lipid isolation and analysis | |||
| 1-propanol | Sigma-Aldrich | 33538 | |
| 10 µl syringe | Hamilton | 701 NR 10 µl | |
| Diethyl ether | Sigma-Aldrich | 346136 | |
| Ethyl acetate | Carl Roth | 7336.2 | |
| Canullla 26G | Braun | 4657683 | |
| Copper(II)sulphatepentahydrate | Merck | 1027805000 | |
| Chloroform | Carl Roth | 7331.1 | |
| CP ATLAS software | Lazarsoftware | 2.0 | |
| Chromolith HighResolution RP-18 endcapped 100-4.6 mm column | Merck | 152022 | |
| High Performance Liquid Chromatograph Chromaster | Hitachi | HITA 892-0080-30Y | Paramaters are dependent on individual HPLC machine |
| HPLC UV Detector | Hitachi | 5410 | |
| HPLC Column Oven | Hitachi | 5310 | |
| HPLC Auto Sampler | Hitachi | 5260 | |
| HPLC Pump | Hitachi | 5160 | |
| Methanol | Carl Roth | 7342.1 | |
| n-Hexane | Carl Roth | 7339.1 | |
| Phosphoric acid | Sigma-Aldrich | 30417 | |
| Potassium chloride | Merck | 49,361,000 | |
| Potters | LAT Garbsen | 5 ml | |
| SDS | Carl Roth | CN30.3 | |
| HPTLC silica gel 60 | Merck | 105553 | |
| Vacufuge plus basic device | Eppendorf | 22820001 | |
| Corning Costar cell culture 48-well plate, flat bottom | Sigma | CLS3548 | |
| Coverslip | Thermo Fisher Scientific | 1198882 | |
| Glass slide | Carl Roth | 1879 | |
| BD Tuberculin Syringe Only 1 ml | BD Bioscience | 309659 |
Referenzen
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