بروتوكول لعن طريق نقل فورستر الرنين الطاقة (الحنق) أجهزة الاستشعار لقياس -Force القوات الميكانيكية عبر مجمع ينك النووية
Summary
A number of FRET-based force biosensors have recently been developed, enabling the protein-specific resolution of intracellular force. In this protocol, we demonstrate how one of these sensors, designed for the linker of the nucleoskeleton-cytoskeleton (LINC) complex protein Nesprin-2G can be used to measure actomyosin forces on the nuclear LINC complex.
Abstract
The LINC complex has been hypothesized to be the critical structure that mediates the transfer of mechanical forces from the cytoskeleton to the nucleus. Nesprin-2G is a key component of the LINC complex that connects the actin cytoskeleton to membrane proteins (SUN domain proteins) in the perinuclear space. These membrane proteins connect to lamins inside the nucleus. Recently, a Förster Resonance Energy Transfer (FRET)-force probe was cloned into mini-Nesprin-2G (Nesprin-TS (tension sensor)) and used to measure tension across Nesprin-2G in live NIH3T3 fibroblasts. This paper describes the process of using Nesprin-TS to measure LINC complex forces in NIH3T3 fibroblasts. To extract FRET information from Nesprin-TS, an outline of how to spectrally unmix raw spectral images into acceptor and donor fluorescent channels is also presented. Using open-source software (ImageJ), images are pre-processed and transformed into ratiometric images. Finally, FRET data of Nesprin-TS is presented, along with strategies for how to compare data across different experimental groups.
Introduction
قوة الحساسة، وقد ظهرت أجهزة الاستشعار الحنق المشفرة وراثيا في الآونة الأخيرة بوصفها أداة هامة لقياس القوى القائم على الشد في الخلايا الحية، وتوفير نظرة ثاقبة كيف القوات الميكانيكية يتم تطبيقها عبر البروتينات 1، 2، 3، 4. مع هذه الأدوات، يمكن للباحثين صورة غير جراحية القوات داخل الخلايا في الخلايا الحية باستخدام المجهر الفلورسنت التقليدية. تتكون هذه المجسات من الحنق الزوج (المانحة والفلورسنت متقبل البروتينات، في معظم الأحيان متبرع الأزرق والأصفر متقبل) مفصولة الببتيد مرنة 3. وعلى النقيض من C- أو علامات N-الطرفية، يتم إدخال هذا الاستشعار إلى موقع داخلي من البروتين لقياس قوة ميكانيكية تنتقل عبر البروتين، ويتصرف باعتباره قياس الضغط الجزيئي. زيادة التوتر الميكانيكية عبر نتائج الاستشعار عن زيادة المسافة بين الحنق فالهواء، مما أدى إلى انخفاض الحنق 3. ونتيجة لذلك، يرتبط الحنق عكسيا مع قوة الشد.
وقد وضعت هذه المجسات على أساس الفلورسنت للبروتينات التنسيق التصاق (فينكولين 3 و تالين 4)، والبروتينات هيكل الخلية (α-actinin 5)، والبروتينات خلية خلية تقاطع (E-كادهيرين 6 و 7 و VE كادهيرين 8، وPECAM 8). ومن المعروف رابط مرونة الأكثر استخداما وتتميز بشكل جيد في هذه المستشعرات الحيوية كما TSmod ويتكون من سلسلة متكررة من 40 الأحماض الأمينية، (GPGGA) 8، والتي كانت مستمدة من سوطي الشكل العنكبوت بروتين الحرير. وقد تبين TSmod أن يتصرف باعتباره الخطي مرنة نانو الربيع، مع الاستجابة الحنق إلى 1-5 السندات الإذنية من قوة الشد 3. أطوال مختلفة من سوطي الشكل يمكن استخدامها لتغيير دينامية صآنج من حساسية TSmod الحنق القوة 9. بالإضافة إلى سوطي الشكل، إسبكترن يكرر 5 و villin خوذة الببتيد (المعروف باسم HP35) 4 وقد استخدمت مثل الببتيدات مرنة بين الحنق أزواج في أجهزة الاستشعار قوة مماثلة 4. وأخيرا، أظهر تقرير صدر مؤخرا أن TSmod يمكن أيضا أن تستخدم لكشف قوات الضغط 10.
نحن وضعت مؤخرا جهاز استشعار القوة لرابط للنواة-الهيكل الخلوي (لينك) بروتين معقد Nesprin2G باستخدام TSmod إدراجها في بروتين Nesprin2G اقتطاع التي سبق وضعها المعروفة باسم مصغرة Nesprin2G (الشكل 2C)، الذي يتصرف على نحو مماثل لالذاتية Nesprin-2G 11. يحتوي المجمع ينك البروتينات المتعددة التي تؤدي من الخارج إلى داخل النواة، ربط الهيكل الخلوي حشوية إلى الصفيحة النووية. Nesprin-2G هو البروتين الهيكلي ملزمة لكل منالهيكل الخلوي الأكتين في السيتوبلازم والبروتينات SUN في الفضاء حول النواة. باستخدام جهاز الاستشعار البيولوجي لدينا، كنا قادرين على إظهار أن Nesprin-2G يخضع لتوتر تعتمد على أكتوميوزين في الخلايا الليفية NIH3T3 2. وكانت هذه هي المرة الأولى التي تقاس تلك القوة مباشرة عبر البروتين في مجمع ينك النووي، وأنه من المرجح أن تصبح أداة هامة لفهم دور القوة على نواة في ميكانيكا الأحياء.
وينص البروتوكول أدناه منهجية مفصلة لكيفية استخدام جهاز استشعار القوة Nesprin-2G، بما في ذلك تعبير عن التوتر استشعار Nesprin (Nesprin-TS) في خلايا الثدييات، فضلا عن اقتناء وتحليل الصور الحنق من الخلايا معربا عن Nesprin- TS. باستخدام مجهر متحد البؤر مقلوب مجهزة للكشف الطيفي، وصفا لكيفية قياس الانبعاثات توعية الحنق تستخدم unmixing الطيفي ويرد ratiometric التصوير الحنق. الصور ratiometric الانتاج يمكن ان تستخدم في صنع منه النسبيمقارنات القوة ntitative. في حين يركز هذا البروتوكول على التعبير عن Nesprin-TS في الخلايا الليفية، وقابل للتكيف بسهولة لخلايا الثدييات الأخرى، بما في ذلك خطوط الخلايا والخلايا الأولية. وعلاوة على ذلك، هذا البروتوكول من حيث صلته الحصول على الصور وتحليلها الحنق يمكن بسهولة أن تتكيف مع أجهزة الاستشعار القوة القائم على الحنق الأخرى التي تم وضعها للبروتينات أخرى.
Protocol
Representative Results
Discussion
وهناك طريقة ومظاهرة من تصوير الخلايا الحية من التوتر الميكانيكية عبر Nesprin-2G، وهو بروتين في مجمع ينك النووي، وقد ورد أعلاه. قبل هذا العمل، تقنيات مختلفة، مثل الطموح micropipette، المغناطيسي حبة الخلوي، والمجهري ليزر الاجتثاث، وقد استخدمت لتطبيق الضغط على نواة الخلية وقياس…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل توماس F. وكيت ميلر جيفريس ميموريال ترست (لDEC) وNIH منح R35GM119617 (لDEC). تم إجراء التصوير المجهر متحد البؤر في مرفق جامعة فرجينيا كومنولث المواد النانوية توصيف الأساسية (NCC).
Materials
| Nesprin-TS DNA | Addgene | 68127 | Retrieve from https://www.addgene.org/68127/ |
| Nesprin-HL DNA | Addgene | 68128 | Retrieve from https://www.addgene.org/68128/ |
| mTFP1 DNA | Addgene | 54613 | Retrieve from https://www.addgene.org/54613/ |
| mVenus DNA | Addgene | 27793 | Retrieve from https://www.addgene.org/27793/ |
| TSmod DNA | Addgene | 26021 | Retrieve from https://www.addgene.org/26021/ |
| Competent Cells | Bioline | BIO-85026 | |
| Liquid LB Media | ThermoFisher | 10855001 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10855001 |
| Solid LB Bacterial Culture Plates | Sigma-Aldrich | L5667 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l5667?lang=en®ion=US |
| Ampicillin | Sigma | A9518 | |
| Spectrophotometer | Biorad | 273 BR 07335 | SmartSpec Plus |
| quartz cuvette | Biorad | 1702504 | Cuvette for SmartSpec Plus |
| DNA isolation kit | Macherey-Nagel | 740412.5 | NucleoBond Xtra Midi Plus |
| 6-well cell culture dish | Falcon-Corning | 353046 | Multiwell 6-well Polystrene Culture Dish |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium, (DMEM) cell media | Gibco | 11995-065 | DMEM(1x) |
| Bovine Serum | Life Technologies | 16170-078 | |
| reduced serum cell media | Gibco | 31985-070 | Reduced Serum Medium, "optimem" |
| Lipid Carrier Solution | invitrogen | 11668-019 | Lipid Reagent, "Lipofectamine 2000" |
| 1.5mL sterile plastic tube | Denville | c2170 | |
| Trypsin | Gibco | 25200-056 | 0.25% Trypsin-EDTA (1x) |
| glass-bottom microscope viewing dish | In Vitro Scientific | D35-20-1.5-N | 35mm Dish with 20mm Bottom Well #1.5 glass |
| Fibronectin | ThermoFisher | 33016015 | fibronectin human protein,plasma |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190-144 | Dulbecco's Phosphate Buffered Saline |
| 15mL sterile centrifuge tube | Greiner bio-one | 188261 | |
| swinging rotor centrifuge | Thermo electron | Centra CL2 | Swinging rotor thermo electron 236 |
| cell culture biosafety hood | Forma Scientific | 1284 | |
| climate controlled cell culture incubator | ThermoFisher | 3596 | |
| inverted LED widefield fluorescent microscope | Life technologies | EVOS FL | |
| Clear HEPES buffered imaging media | Molecular Probes | A14291DJ | |
| Fetal bovine Serum | Life technologies | 10437-028 | |
| Temperature Controlled-Inverted confocal w/458 and 515nm laser sources | Zeiss | LSM 710-w/spectral META detector | |
| Outgrowth Media | Newengland Biolabs | B9020s | |
| NIH 3T3 Fibroblasts | ATCC | CRL-1658 |
Referenzen
- Conway, D. E., Schwartz, M. A. Flow-dependent cellular mechanotransduction in atherosclerosis. J Cell Sci. 126, 5101-5109 (2013).
- Arsenovic, P. T., Ramachandran, I., et al. Nesprin-2G, a Component of the Nuclear LINC Complex, Is Subject to Myosin-Dependent Tension. Biophys J. 110 (1), 34-43 (2016).
- Grashoff, C., Hoffman, B. D., et al. Measuring mechanical tension across vinculin reveals regulation of focal adhesion dynamics. Nature. 466 (7303), 263-266 (2010).
- Austen, K., Ringer, P., et al. Extracellular rigidity sensing by talin isoform-specific mechanical linkages. Nat Cell Bio. 17 (12), 1597-1606 (2015).
- Meng, F., Sachs, F. Visualizing dynamic cytoplasmic forces with a compliance-matched FRET sensor. J Cell Sci. 124, 261-269 (2011).
- Borghi, N., Sorokina, M., et al. E-cadherin is under constitutive actomyosin-generated tension that is increased at cell-cell contacts upon externally applied stretch. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (31), 12568-12573 (2012).
- Cai, D., Chen, S. -. C., et al. Mechanical Feedback through E-Cadherin Promotes Direction Sensing during Collective Cell Migration. Cell. 157 (5), 1146-1159 (2014).
- Conway, D. E., Breckenridge, M. T., Hinde, E., Gratton, E., Chen, C. S., Schwartz, M. A. Fluid Shear Stress on Endothelial Cells Modulates Mechanical Tension across VE-Cadherin and PECAM-1. Curr Bio CB. 23 (11), 1024-1030 (2013).
- Brenner, M. D., Zhou, R., et al. Spider Silk Peptide Is a Compact, Linear Nanospring Ideal for Intracellular Tension Sensing. Nano Lett. 16 (3), 2096-2102 (2016).
- Rothenberg, K. E., Neibart, S. S., LaCroix, A. S., Hoffman, B. D. Controlling Cell Geometry Affects the Spatial Distribution of Load Across Vinculin. Cell Mol Bioeng. 8 (3), 364-382 (2015).
- Ostlund, C., Folker, E. S., Choi, J. C., Gomes, E. R., Gundersen, G. G., Worman, H. J. Dynamics and molecular interactions of linker of nucleoskeleton and cytoskeleton (LINC) complex proteins. J Cell Sci. 122, 4099-4108 (2009).
- Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. J Vis Exp. (6), e253 (2007).
- Zhang, S., Cahalan, M. D. Purifying plasmid DNA from bacterial colonies using the QIAGEN Miniprep Kit. J Vis Exp. (6), e247 (2007).
- Rodighiero, S., Bazzini, C., et al. Fixation, mounting and sealing with nail polish of cell specimens lead to incorrect FRET measurements using acceptor photobleaching. Cell. Physiol. Biochem. 21 (5-6), 489-498 (2008).
- Kardash, E., Bandemer, J., Raz, E. Imaging protein activity in live embryos using fluorescence resonance energy transfer biosensors. Nat Protoc. 6 (12), 1835-1846 (2011).
- Vaziri, A., Mofrad, M. R. K. Mechanics and deformation of the nucleus in micropipette aspiration experiment. J Biomech. 40 (9), 2053-2062 (2007).
- Wang, N., Naruse, K., et al. Mechanical behavior in living cells consistent with the tensegrity model. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (14), 7765-7770 (2001).
- Nagayama, K., Yahiro, Y., Matsumoto, T. Stress fibers stabilize the position of intranuclear DNA through mechanical connection with the nucleus in vascular smooth muscle cells. FEBS letters. 585 (24), 3992-3997 (2011).
- Luxton, G. W. G., Gomes, E. R., Folker, E. S., Vintinner, E., Gundersen, G. G. Linear arrays of nuclear envelope proteins harness retrograde actin flow for nuclear movement. Science. 329 (5994), 956-959 (2010).
- Chen, Y., Mauldin, J. P., Day, R. N., Periasamy, A. Characterization of spectral FRET imaging microscopy for monitoring nuclear protein interactions. J Microsc. 228, 139-152 (2007).
- Ran, F. A., Hsu, P. D., Wright, J., Agarwala, V., Scott, D. A., Zhang, F. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- LaCroix, A. S., Rothenberg, K. E., Berginski, M. E., Urs, A. N., Hoffman, B. D. Construction, imaging, and analysis of FRET-based tension sensors in living cells. Methods Cell Biol. , (2015).
