Un protocole pour l'utilisation Förster Resonance Energy Transfer (FRET) -force biocapteurs pour mesurer les forces mécaniques à travers le complexe nucléaire LINC
Summary
A number of FRET-based force biosensors have recently been developed, enabling the protein-specific resolution of intracellular force. In this protocol, we demonstrate how one of these sensors, designed for the linker of the nucleoskeleton-cytoskeleton (LINC) complex protein Nesprin-2G can be used to measure actomyosin forces on the nuclear LINC complex.
Abstract
The LINC complex has been hypothesized to be the critical structure that mediates the transfer of mechanical forces from the cytoskeleton to the nucleus. Nesprin-2G is a key component of the LINC complex that connects the actin cytoskeleton to membrane proteins (SUN domain proteins) in the perinuclear space. These membrane proteins connect to lamins inside the nucleus. Recently, a Förster Resonance Energy Transfer (FRET)-force probe was cloned into mini-Nesprin-2G (Nesprin-TS (tension sensor)) and used to measure tension across Nesprin-2G in live NIH3T3 fibroblasts. This paper describes the process of using Nesprin-TS to measure LINC complex forces in NIH3T3 fibroblasts. To extract FRET information from Nesprin-TS, an outline of how to spectrally unmix raw spectral images into acceptor and donor fluorescent channels is also presented. Using open-source software (ImageJ), images are pre-processed and transformed into ratiometric images. Finally, FRET data of Nesprin-TS is presented, along with strategies for how to compare data across different experimental groups.
Introduction
Sensible à la force, des capteurs de FRET codés génétiquement ont récemment émergé comme un outil important pour mesurer des forces de traction à base de cellules vivantes, donnant un aperçu de la manière dont les forces mécaniques sont appliquées sur les protéines 1, 2, 3, 4. Avec ces outils, les chercheurs peuvent acquérir des images non effractive forces intracellulaires dans les cellules vivantes en utilisant des microscopes fluorescents classiques. Ces capteurs sont constitués d'une paire FRET (donneur et accepteur protéines fluorescentes, le plus souvent un donneur et accepteur bleu jaune) séparées par un peptide élastique 3. Contrairement à C- ou le marquage N-terminal, ce capteur est inséré dans un site interne d'une protéine pour mesurer la force mécanique transmise à travers la protéine, se comportant comme une jauge de contrainte moléculaire. Augmentation de la tension mécanique sur les résultats de détection à une distance accrue entre le FRET-pair, entraînant une diminution de FRET 3. En conséquence, le FRET est inversement proportionnelle à la force de traction.
Ces capteurs à base de fluorescence ont été développés pour des protéines d'adhésion focale (de vinculine 3 et Talin 4), les protéines du cytosquelette (α-actinine 5), et des protéines de jonction cellule-cellule (E-cadhérine 6, 7, VE-cadhérine 8, et PECAM 8). Le segment de liaison élastique le plus fréquemment utilisé et bien caractérisés dans ces biocapteurs est connu comme TSmod et se compose d'une séquence répétitive de 40 acides aminés, (GPGGA) 8, qui a été dérivée de la protéine de soie d'araignée flagelliforme. TSmod a été montré pour se comporter comme un ressort élastique nano-linéaire, avec une réactivité de FRET à 1 à 5 pN de la force de traction 3. Différentes longueurs de flagelliformes peuvent être utilisés pour modifier la dynamique range de la sensibilité de la force de FRET TSmod 9. En plus de flagelliformes, spectrine répète 5 et villine peptide de tête (connu sous le nom HP35) 4 ont été utilisés comme peptides élastiques entre les paires de FRET dans des biocapteurs de force similaire 4. Enfin, un récent rapport a montré que TSmod peut également être utilisé pour détecter les forces de compression 10.
Nous avons récemment développé un capteur de force pour la liaison de la nucléo-cytosquelette (CLIC) complexe de protéines en utilisant Nesprin2G TSmod inséré dans une protéine tronquée Nesprin2G développé précédemment connu sous le mini-Nesprin2G (figure 2C), qui se comporte de manière similaire à endogène Nesprin-2G 11. Le complexe CLIC contient plusieurs protéines qui mènent de l'extérieur vers l'intérieur du noyau, reliant le cytosquelette cytoplasmique de la lamina nucléaire. Nesprin-2G est une protéine structurale lie à la fois à lacytosquelette d'actine dans le cytoplasme et aux protéines SUN dans l'espace périnucléaire. En utilisant notre biocapteur, nous avons pu montrer que Nesprin-2G est soumis à une tension dépendant de actomyosine dans les fibroblastes NIH3T3 2. Ce fut la première fois que la force a été mesurée directement sur une protéine dans le complexe nucléaire LINC, et il est susceptible de devenir un outil important pour comprendre le rôle de la force sur le noyau en mécanobiologie.
Le protocole ci-dessous fournit une méthodologie détaillée de la façon d'utiliser le capteur de force Nesprin-2G, y compris l'expression du capteur de tension Nesprin (Nesprin-TS) dans des cellules de mammifères, ainsi que l'acquisition et l'analyse des images de FRET de cellules exprimant Nesprin- TS. En utilisant un microscope confocal inversé équipé d'un détecteur spectral, une description de la façon de mesurer l'émission sensibilisée FRET utilisant déconvolution spectrale et l'imagerie ratiométrique de FRET est fourni. Les images de sortie ratiométrique peuvent être utilisés pour faire en tant que parentComparaisons des forces ntitative. Bien que ce protocole se concentre sur l'expression de Nesprin-TS dans des fibroblastes, il est facilement adaptable à d'autres cellules de mammifères, y compris les lignées cellulaires et les cellules primaires. En outre, ce protocole en ce qui concerne l'acquisition et l'analyse FRET image peut être facilement adaptée à d'autres biocapteurs de force sur la base de FRET qui ont été développés pour d'autres protéines.
Protocol
Representative Results
Discussion
Un procédé et la démonstration d'imagerie des cellules vivantes de la tension mécanique dans Nesprin-2G, une protéine dans le complexe nucléaire CLIC, a été décrit ci-dessus. Avant ces travaux, diverses techniques, telles que l' aspiration par micropipette, cytométrie magnétique bourrelet, et l' ablation au laser au microscope, ont été utilisés pour appliquer de pression sur le noyau de la cellule et à mesurer les propriétés des matériaux en vrac 16, <sup …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par le Thomas F. Miller et Kate Jeffress Memoria Trust (à DEC) et des subventions du NIH R35GM119617 (à DEC). L'imagerie par microscopie confocale a été réalisée au Centre de VCU Caractérisation de base Nanomatériaux (CCN).
Materials
| Nesprin-TS DNA | Addgene | 68127 | Retrieve from https://www.addgene.org/68127/ |
| Nesprin-HL DNA | Addgene | 68128 | Retrieve from https://www.addgene.org/68128/ |
| mTFP1 DNA | Addgene | 54613 | Retrieve from https://www.addgene.org/54613/ |
| mVenus DNA | Addgene | 27793 | Retrieve from https://www.addgene.org/27793/ |
| TSmod DNA | Addgene | 26021 | Retrieve from https://www.addgene.org/26021/ |
| Competent Cells | Bioline | BIO-85026 | |
| Liquid LB Media | ThermoFisher | 10855001 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10855001 |
| Solid LB Bacterial Culture Plates | Sigma-Aldrich | L5667 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l5667?lang=en®ion=US |
| Ampicillin | Sigma | A9518 | |
| Spectrophotometer | Biorad | 273 BR 07335 | SmartSpec Plus |
| quartz cuvette | Biorad | 1702504 | Cuvette for SmartSpec Plus |
| DNA isolation kit | Macherey-Nagel | 740412.5 | NucleoBond Xtra Midi Plus |
| 6-well cell culture dish | Falcon-Corning | 353046 | Multiwell 6-well Polystrene Culture Dish |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium, (DMEM) cell media | Gibco | 11995-065 | DMEM(1x) |
| Bovine Serum | Life Technologies | 16170-078 | |
| reduced serum cell media | Gibco | 31985-070 | Reduced Serum Medium, "optimem" |
| Lipid Carrier Solution | invitrogen | 11668-019 | Lipid Reagent, "Lipofectamine 2000" |
| 1.5mL sterile plastic tube | Denville | c2170 | |
| Trypsin | Gibco | 25200-056 | 0.25% Trypsin-EDTA (1x) |
| glass-bottom microscope viewing dish | In Vitro Scientific | D35-20-1.5-N | 35mm Dish with 20mm Bottom Well #1.5 glass |
| Fibronectin | ThermoFisher | 33016015 | fibronectin human protein,plasma |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190-144 | Dulbecco's Phosphate Buffered Saline |
| 15mL sterile centrifuge tube | Greiner bio-one | 188261 | |
| swinging rotor centrifuge | Thermo electron | Centra CL2 | Swinging rotor thermo electron 236 |
| cell culture biosafety hood | Forma Scientific | 1284 | |
| climate controlled cell culture incubator | ThermoFisher | 3596 | |
| inverted LED widefield fluorescent microscope | Life technologies | EVOS FL | |
| Clear HEPES buffered imaging media | Molecular Probes | A14291DJ | |
| Fetal bovine Serum | Life technologies | 10437-028 | |
| Temperature Controlled-Inverted confocal w/458 and 515nm laser sources | Zeiss | LSM 710-w/spectral META detector | |
| Outgrowth Media | Newengland Biolabs | B9020s | |
| NIH 3T3 Fibroblasts | ATCC | CRL-1658 |
Referenzen
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