Gelijktijdige meting van mitochondriale calcium en mitochondriale membraan potentieel in levende cellen door fluorescentie microscopie

Summary

Mitochondriën kan de elektrochemische potentiaal over hun binnenste membraan (Δ _Ψm) te gebruiken om calcium sekwestreren (Ca ^2+), waardoor ze vorm te geven cytosolische Ca ²⁺ het signaleren binnen de cel. We beschrijven een werkwijze voor het gelijktijdig meten van mitochondriën Ca2 ⁺ opname en ΔΨ _m in levende cellen met fluorescerende kleurstoffen en confocale microscopie.

Abstract

Naast hun essentiële rol bij het genereren van ATP, mitochondriën ook als lokale calcium (Ca2 ⁺⁾ buffers strak reguleren de intracellulaire Ca2 ⁺ -concentratie. Om dit te doen, mitochondriën gebruik maken van de elektrochemische potentiaal over hun binnenste membraan (ΔΨ _m) naar sekwestreren Ca ^2+. De instroom van Ca ²⁺ in de mitochondriën stimuleert drie snelheidsbeperkende dehydrogenases van de citroenzuurcyclus, het verhogen van elektronen overdracht via de oxidatieve fosforylering (OXPHOS) complexen. Deze stimulatie stelt ΔΨ _m, die tijdelijk wordt opgenomen als positieve calciumionen steekt de binnenste mitochondriale membraan in de mitochondriale matrix.

We beschrijven hier een werkwijze voor het gelijktijdig meten van mitochondriën Ca2 ⁺ opname en ΔΨ _m in levende cellen met behulp van confocale microscopie. Doordringbaar door de cellen, mitochondriale Ca2 ⁺ kanworden gemeten met de fluorescerende Ca2 ⁺ indicator Fluo-4, AM, met bepaling van de ΔΨ _m met de fluorescente kleurstof tetramethylrhodamine, methylester, perchloraat (TMRM). Het voordeel van dit systeem is dat er zeer weinig spectrale overlap tussen de fluorescerende kleurstoffen, waardoor accurate meting van mitochondriale Ca2 ⁺ en _m gelijktijdig ΔΨ. Met de opeenvolgende toevoeging van Ca2 ⁺ aliquots, mitochondrial Ca2 ⁺ opname kan worden gevolgd, en de concentratie waarbij Ca2 ⁺ induceert mitochondriale permeabiliteit transitie en het verlies van ΔΨ _m bepaald.

Introduction

Mitochondriën spelen een belangrijke rol in het reguleren van intracellulaire Ca2 ⁺ -concentratie door als lokale Ca2 ⁺ buffers ^1. Ca ²⁺ komt in de mitochondriën via het Ca ²⁺ uniporter, een proces gedreven door de elektrochemische gradiënt die over het mitochondriale binnenste membraan (ΔΨ _m) ² bestaat. Eenmaal in de mitochondriale matrix, kunnen Ca2 ⁺ oxidatieve fosforylatie activeren door het stimuleren drie snelheidsbeperkende dehydrogenases van de citroenzuurcyclus ^3. Deze stimulatie stelt ΔΨ _m, die tijdelijk wordt opgenomen als positieve calciumionen steekt de binnenste mitochondriale membraan in de mitochondriale matrix. Als de Ca2 ⁺ -concentratie in de mitochondriën erg hoog wordt, kan mitochondriale permeabiliteitsovergang worden gestart, waardoor de dissipatie van ΔΨ _m, de cessation van oxidatieve fosforylering en de inductie van celdood signaalroutes ^4.

De belangrijke rol die de mitochondriën spelen in de ruimtelijke buffering van cellulaire calcium maakt de nauwkeurige monitoring van mitochondriale calcium kritisch. Verschillende methoden zijn vastgesteld mitochondriale calcium, waaronder het gebruik van rhodamine gebaseerde kleurstoffen controleren. Een dergelijke kleurstof, Rhod-2, AM, is zeer effectief in verdeling naar de mitochondriën mitochondriale Ca2 ⁺ niveaus ^{5 meten 6.} Wel moet erop worden gebruikt als een kleurstof ophopen in andere organellen, zoals liposomen of blijven in de cel cytosol. Niettemin kan stroomafwaarts analyses worden gebruikt om deze signalen te onderscheiden van die van de mitochondriën ^7.

Een andere techniek om mitochondriale calcium monitoren gebruikt fluorescente reporter constructen ⁸ </s up>. Het voordeel van deze genetisch gecodeerde probes is dat ze specifiek naar de mitochondriën kan worden gericht door endogene N-eindstandige peptiden, bijvoorbeeld de N-terminale targeting signaal menselijke COX subeenheid VIII. Dit systeem is gebruikt om een mitochondriaal aequorine gerichte probe die uiterst nuttig voor het onderzoeken van mitochondriale calcium signaling ⁹ is gebleken genereren. Het belangrijkste nadeel van deze genetisch gecodeerde probes is dat ze moeten in de cellen door tijdelijke expressie worden ingevoerd (die niet haalbaar is voor bepaalde celtypes en kunnen variabele resultaten) of door stabiele expressiesystemen (die tijdrovend).

Om de hierboven geschetste problemen te omzeilen, hebben we een nieuw protocol ontwikkeld om mitochondriale Ca ²⁺ en ΔΨ _m gelijktijdig meten. Dit protocol is gebaseerd op een eerder beschreven methode exogeen calcium bijdraagt ​​aan gepermeabiliseerde cellens = "xref"> 10. Ons protocol heeft drie belangrijke voordelen ten opzichte van andere methoden: ten eerste maken we gebruik van Fluo-4, AM en TMRM om mitochondriale Ca ²⁺ en ΔΨ _m, twee kleurstoffen die zeer verschillende spectrale eigenschappen volgen; ten tweede worden de cellen permeabel gemaakt zodat de Fluo-4 signaal alleen detecteert mitochondriale Ca2 ⁺ en Ca2 ⁺ niet gelokaliseerd op andere organellen en de cel cytosol; en ten derde, het gebruik van Fluo-4 mitochondriale Ca ²⁺ detecteren maakt een snelle en eenvoudige celkleuring, ontkennen elke cel transfectie of transformatie problemen die bestaan bij gebruik van genetisch gecodeerde probes.

Protocol

1. Bereiding van Cellen Kweek cellen op 10 cm celcultuurschalen of 75 cm2 kolven in kweekmedium [10 ml Dulbecco's gemodificeerd Eagles Medium (DMEM) aangevuld met 5% (v / v) foetaal runderserum (FBS) en 1 x penicilline / streptomycine (P / S )] bij 37 ° C / 5% CO2. Om cellen te oogsten, verwijder media door aspiratie, daarna wassen met 5 ml 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (1x PBS). Verwijderen 1x PBS door afzuigen, voeg 1,5 ml 0,25% (w / v) Trypsine / 0,25% (w / v) eth…

Representative Results

We hebben dit protocol gebruikt om de gevolgen van een MT-ND5 mutatie op het vermogen van mitochondriën 143B verhogingen buffer calcium 12 onderzocht. In het hier getoonde voorbeeld, werden controle 143B cellen opgeladen met TMRM en Fluo-4, AM voor permeabilisatie met digitonine. Na 5 min imaging, acht achtereenvolgende toevoegingen van een 1: 100 verdunning werden van 40 mM CaCl2 exogeen gemaakt met de laatste vrije Ca2 + ionconcen…

Discussion

Calcium speelt een cruciale rol in vele celprocessen, waaronder spiercontractie, neuronale signalering en celproliferatie ^13. Toename in cel calciumconcentraties worden vaak geassocieerd met energievraag, met calcium rechtstreeks kan stimuleren mitochondriale oxidatieve fosforylering ATP generatie ³ verhogen. Het is daarom van essentieel belang dat we de mogelijkheid hebben om effectief toezicht mitochondriale calcium accumulatie en om te kunnen vergelijken hoe deze functi…

Materials

Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	ThermoFisher	10566016
fetal bovine serum (FBS)	ThermoFisher	16000044
1x phosphate buffered saline (PBS)	ThermoFisher	10010023
100x penicillin/streptomycin (p/s)	ThermoFisher	15140122
0.25% Trypsin / 0.25% EDTA	ThermoFisher	25200056
8-well chambered coverslip	ibidi	80826
NaCl	Sigma-Aldrich	793566
KCl	Sigma-Aldrich	P9541
MgSO4	Sigma-Aldrich	746452
KH2PO4	Sigma-Aldrich	795488
D-glucose	Sigma-Aldrich	G8270
CaCl2	Sigma-Aldrich	746495
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
MgCl2	Sigma-Aldrich	M2670
EGTA	Sigma-Aldrich	E4378
HEDTA	Sigma-Aldrich	H8126
malate	Sigma-Aldrich	M1000
glutamate	Sigma-Aldrich	G1626
ADP	Sigma-Aldrich	A5285
Ca2+ free Hank’s buffered salt solution (HBSS)	ThermoFisher	14175-095
tetramethylrhodamine, methyl ester, perchlorate (TMRM)	ThermoFisher	T668
Verapamil	Sigma-Aldrich	V4629
Fluo-4 acetoxymethyl ester (Fluo-4, AM)	ThermoFisher	F14201
dimethyl sulfoxide (DMSO)	ThermoFisher	D12345
carbonyl cyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP)	Sigma-Aldrich	C2920
digitonin	Sigma-Aldrich	D141
thapsigargin	Sigma-Aldrich	T9033
Pluronic F-127	ThermoFisher	P3000MP
hemacytometer	VWR	631-0925
10 cm cell culture dishes	Corning	COR430167
75 cm2 cell culture flasks	Corning	COR430641