蛍光顕微鏡による生細胞内のミトコンドリアのカルシウムとミトコンドリア膜電位の同時測定
Summary
ミトコンドリアは、それらが細胞内の細胞質ゾルのCa 2+シグナル伝達を形成することができ、カルシウム（Ca 2+）隔離する彼らの内膜（ΔΨm）を横切って電気化学ポテンシャルを利用することができます。我々は、同時に、蛍光色素、共焦点顕微鏡を使用して、生細胞中のミトコンドリアの Ca 2+取り込みおよびΔΨmを測定するための方法を記載します。
Abstract
別にATPを生成する際に、それらの本質的な役割から、ミトコンドリアはまた、地元のカルシウム（Ca 2+）として機能緊密細胞内Ca 2+濃度を調節するためにバッファリングします。これを行うには、ミトコンドリアは、Ca 2+を封鎖するために彼らの内膜（ΔΨmの）全体に電気化学ポテンシャルを利用しています。ミトコンドリアへの Ca 2+の流入は、酸化的リン酸化（OXPHOS）錯体を介して電子伝達を増加させる、クエン酸サイクルの三律速デヒドロゲナーゼを刺激します。この刺激は、正のカルシウムイオンがミトコンドリアマトリックスにミトコンドリア内膜を横切るように一時的に放散されΔΨmを 、保持しています。
ここでは、同時に、共焦点顕微鏡を用いて、ミトコンドリアに生細胞におけるCa 2+取り込みおよびΔΨmを測定する方法について説明します。細胞を透過性により、ミトコンドリアのCa 2+することができます蛍光色素テトラメチルローダミンを用いて、ΔΨmの、メチルエステル、過塩素酸塩（TMRM）の測定を、蛍光の Ca 2+指示薬のFluo-4、AMを使用して測定します。このシステムの利点は、同時にミトコンドリアの Ca 2+及びΔΨMの正確な測定を可能にする蛍光色素との間の非常に小さなスペクトルの重なりがあることです。 Ca 2+アリコートの連続添加を用いて、ミトコンドリアの Ca 2+取り込みを監視することができ、およびCa 2+は 、ミトコンドリア膜透過性遷移とΔΨの損失を誘発する濃度を決定mです 。
Introduction
ミトコンドリアは、ローカルの Ca 2+緩衝液1として作用することにより、細胞内Ca 2+濃度の調節において重要な役割を果たしています。 Ca 2+のCa 2+ユニポーター、ミトコンドリア内膜（ΔΨmの）2を横切って存在する電気化学的勾配によって駆動されるプロセスを介してミトコンドリアに入ります。いったんミトコンドリアマトリックス内部に、Ca 2+がクエン酸回路3の3律速デヒドロゲナーゼを刺激することによって、酸化的リン酸化を活性化することができます。この刺激は、正のカルシウムイオンがミトコンドリアマトリックスにミトコンドリア内膜を横切るように一時的に放散されΔΨmを 、保持しています。ミトコンドリア内のCa 2+濃度が非常に高くなる場合は、ミトコンドリア透過性転移は、ΔΨmの損失で、その結果、開始することができ、cessatio酸化的リン酸化のNおよび経路4シグナル 、細胞死の誘導。
ミトコンドリアは細胞内カルシウムの空間的なバッファリングで果たす重要な役割は、ミトコンドリアのカルシウムの正確なモニタリングが重要なことができます。様々な方法は、ローダミン系染料の使用を含む、ミトコンドリアのカルシウムを監視するために確立されています。そのような染料、Rhod-2 AMは、6はミトコンドリアのCa 2+レベル5を測定するためにミトコンドリアに分割に非常に効果的です。ただし、注意がいくつかの染料は、リポソームのような他の細胞小器官に蓄積し、または細胞質ゾルに留まるとして使用する必要があります。それにもかかわらず、下流の分析は、ミトコンドリア7のものから、これらの信号を区別するために使用することができます。
ミトコンドリアのカルシウムを監視するための別の技術は蛍光レポーターが8を構築し利用します</s >アップ。これらの遺伝的にコードされたプローブの利点は、特に、例えば、ヒトCOXサブユニットVIIIのN末端標的化シグナルを内因性のN末端ペプチドを用いて、ミトコンドリアを標的とすることができるということです。このシステムは、9シグナリングミトコンドリアカルシウムを調査するために非常に有用であることが証明されている、ミトコンドリア標的エクオリンプローブを生成するために使用されてきました。これらの遺伝的にコードされたプローブの主な欠点は、（特定の細胞型のために実行可能ではなく、変数の結果を生成することができる）の一過性発現によって、または（時間がかかる場合）安定な発現系を作成することにより、細胞内に導入する必要があることです。
上記概説した問題を回避するために、我々は同時に、ミトコンドリアのCa 2+とΔΨ メートルを測定するための新しいプロトコルを開発しました。このプロトコルは、透過性細胞への外因性のカルシウムを追加し、以前に記載された方法に基づいていますS = "外部参照"> 10。私たちのプロトコルは、他の方法に比べて3の主な利点があります：まず、我々は、ミトコンドリアのCa 2+とのΔΨ メートル 、非常に異なるスペクトル特性を有する2つの染料を監視するために、AMとTMRMをのFluo-4を使用します。第二のFluo-4信号のみがミトコンドリアのCaを検出しているように、細胞を透過処理されている2+およびCa 2+他の細胞小器官または細胞質ゾルに局在化していません。第三に、ミトコンドリアのCaを検出するためのFluo-4の使用は2+遺伝的にコードされたプローブを使用している場合に存在する任意の細胞トランスフェクションまたは形質転換の問題を否定する、高速かつ簡単な細胞染色を可能にします。
Protocol
Representative Results
Discussion
カルシウムは筋収縮、神経伝達および細胞増殖13を含む多くの細胞プロセスにおいて重要な役割を果たしています。細胞カルシウム濃度の増加は、多くの場合、直接ATP世代3を上昇させるために、ミトコンドリアの酸化的リン酸化を刺激することができるカルシウムで、エネルギー需要と関連しています。我々が効果的にミトコンドリアのカルシウム蓄積を?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、財政支援のために博士Kirstin Elgassおよび技術支援のためのモナッシュマイクロイメージングから博士サラ・クリード、およびウェルカム・トラストおよび医学研究評議会、英国に感謝します。 MMcKは、オーストラリアの研究評議会今後のフェローシップ制度（FT120100459）、ウィリアム・バックランド財団、オーストラリアのミトコンドリア病財団（AMDF）、医学研究、モナッシュ大学のハドソン研究所がサポートされています。この作品は、ビクトリア州政府運用インフラ支援スキームによってサポートされていました。
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | ThermoFisher | 10566016 |
| fetal bovine serum (FBS) | ThermoFisher | 16000044 |
| 1x phosphate buffered saline (PBS) | ThermoFisher | 10010023 |
| 100x penicillin/streptomycin (p/s) | ThermoFisher | 15140122 |
| 0.25% Trypsin / 0.25% EDTA | ThermoFisher | 25200056 |
| 8-well chambered coverslip | ibidi | 80826 |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 793566 |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 746452 |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 795488 |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 746495 |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M2670 |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 |
| HEDTA | Sigma-Aldrich | H8126 |
| malate | Sigma-Aldrich | M1000 |
| glutamate | Sigma-Aldrich | G1626 |
| ADP | Sigma-Aldrich | A5285 |
| Ca2+ free Hank’s buffered salt solution (HBSS) | ThermoFisher | 14175-095 |
| tetramethylrhodamine, methyl ester, perchlorate (TMRM) | ThermoFisher | T668 |
| Verapamil | Sigma-Aldrich | V4629 |
| Fluo-4 acetoxymethyl ester (Fluo-4, AM) | ThermoFisher | F14201 |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | ThermoFisher | D12345 |
| carbonyl cyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 |
| digitonin | Sigma-Aldrich | D141 |
| thapsigargin | Sigma-Aldrich | T9033 |
| Pluronic F-127 | ThermoFisher | P3000MP |
| hemacytometer | VWR | 631-0925 |
| 10 cm cell culture dishes | Corning | COR430167 |
| 75 cm2 cell culture flasks | Corning | COR430641 |
Referenzen
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