Human Lung dendritische cellen: ruimtelijke verdeling en fenotypische Identification in Endobronchiale biopten middels immunohistochemie en flowcytometrie
Summary
Lung-resident immune cells, including dendritic cells (DCs) in humans, are critical for defense against inhaled pathogens and allergens. However, due to the scarcity of human lung tissue, studies are limited. This work presents protocols to process human mucosal endobronchial biopsies for studying lung DCs using immunohistochemistry and flow cytometry.
Abstract
The lungs are constantly exposed to the external environment, which in addition to harmless particles, also contains pathogens, allergens, and toxins. In order to maintain tolerance or to induce an immune response, the immune system must appropriately handle inhaled antigens. Lung dendritic cells (DCs) are essential in maintaining a delicate balance to initiate immunity when required without causing collateral damage to the lungs due to an exaggerated inflammatory response. While there is a detailed understanding of the phenotype and function of immune cells such as DCs in human blood, the knowledge of these cells in less accessible tissues, such as the lungs, is much more limited, since studies of human lung tissue samples, especially from healthy individuals, are scarce. This work presents a strategy to generate detailed spatial and phenotypic characterization of lung tissue resident DCs in healthy humans that undergo a bronchoscopy for the sampling of endobronchial biopsies. Several small biopsies can be collected from each individual and can be subsequently embedded for ultrafine sectioning or enzymatically digested for advanced flow cytometric analysis. The outlined protocols have been optimized to yield maximum information from small tissue samples that, under steady-state conditions, contain only a low frequency of DCs. While the present work focuses on DCs, the methods described can directly be expanded to include other (immune) cells of interest found in mucosal lung tissue. Furthermore, the protocols are also directly applicable to samples obtained from patients suffering from pulmonary diseases where bronchoscopy is part of establishing the diagnosis, such as chronic obstructive pulmonary disease (COPD), sarcoidosis, or lung cancer.
Introduction
De longen zijn voortdurend in contact met de buitenomgeving en zijn zeer gevoelig voor zowel onschadelijke deeltjes en microben met het vermogen om ziekte te veroorzaken. Daarom is het essentieel voor het immuunsysteem potente immune responsen tegen binnendringende pathogenen te monteren, maar het is even belangrijk om tolerantie te behouden om geïnhaleerde antigenen die geen ziekte veroorzaken. Potente immune surveillance, wordt het ademhalingssysteem bekleed met een netwerk van immuuncellen, waaronder dendritische cellen (DCs). DCs zijn professionele antigeenpresenterende cellen met het unieke vermogen om naïeve T-cellen te activeren. In menselijke longen, resident DC treedt een antigeen en vervolgens verwerken en transporteren deze naar de long-drainerende lymfeknopen voor presentatie aan en activering van T-cellen 1, 2, 3.
In het menselijke immuunsysteem, kan DCs worden onderverdeeld in verschillende subgroepen, met Distinct maar overlappende functies: cd1c + en CD141 + myeloïde DCs (MDCs) en CD123 + plasmacytoide DCs (PDC's) 4, 5. Terwijl de meest gedetailleerde kennis over humane DCs afkomstig uit studies in bloed, is het nu duidelijk dat de menselijke longen ook haven zeldzame populaties van DC subsets met T-cel stimulerende capaciteit 6, 7, 8, 9. Echter, accumuleren gegevens blijkt dat immuuncellen, zoals DCs verschillen in frequentie, fenotype en functie afhankelijk van de anatomische locatie 10. Derhalve is het belangrijk om immuuncellen bestuderen van de desbetreffende weefsel hun bijdrage aan lokale immuniteit en tolerantie begrijpen. Bij elkaar genomen, dit onderstreept de noodzaak om long-resident DCs studeren bij de aanpak van longziekten, ondanks het bloed DC's die meer direct beschikbaar en toegankelijk bij mensen.
De eerste studies die long-DCs resident bij mensen onderzocht zich primair op morfologie en de expressie van één markers, zoals HLA-DR en CD 11 c, in weefselsecties middels immunohistochemie 11, 12, 13. Daarentegen recentere studies doorgaans gebruikt flowcytometrische analyses verschillende immuuncelsubklassen bestuderen. Aangezien het moeilijk is om een celoppervlak marker die uniek identificeert een bepaald DC deelverzameling vinden potentiële beperking van studies die alleen vier kleuren flowcytometrie is het risico van het opnemen celpopulaties met gelijke fenotypische markers als DCs. Zo wordt CD11c uitgedrukt op alle myeloïde DC en de meeste monocyten. Anderzijds, in studies toepassing geavanceerdere flowcytometrie panelen werden goedaardige longweefsel van chirurgische resectie patiënten typisch gebruiktxref "> 10, 14, 15, 16, hoewel het onduidelijk is of deze zeldzame populaties werkelijk representatief DCs bij gezonde proefpersonen. Kortom, zijn studies grotendeels beperkt door het feit dat operatief verwijderd of volledig menselijk longweefsel schaars.
Om een aantal van deze beperkingen te overwinnen, dit werk wordt beschreven hoe u een gedetailleerde analyse van de ruimtelijke verdeling en een fenotypische identificatie van DCs in mucosale endobronchiale biopsieën verkregen bij gezonde vrijwilligers die een bronchoscopie ondergaan, uit te voeren. Verschillende kleine biopten kunnen worden verzameld van elk individu en vervolgens kan worden ingebed voor het snijden en analyse met behulp van immunohistochemie of enzymatisch verteerd voor geavanceerde flowcytometrische analyse. Via long weefsel in de vorm van endobronchiale biopsieën verkregen bronchoscopies verleent het voordeel dat het mogelijk de st voerenUdy op gezonde vrijwilligers, anders dan open chirurgie van de longen die voor de hand liggende redenen, is beperkt tot patiënten die thoracale chirurgie. Bovendien het weefsel dat wordt bemonsterd tijdens een bronchoscopie van gezonde vrijwilligers fysiologisch normaal, in tegenstelling tot een niet-getroffen gebied van longweefsel bij patiënten met een longziekte. Anderzijds, de biopsieën zijn klein en het aantal cellen teruggehaald, zelfs als pooling meerdere biopten, beperkt het soort analyses kunnen worden uitgevoerd.
Hoewel de huidige werk richt zich op DCs, de beschreven kan direct worden uitgebreid methoden om andere (immuun) cellen van belang dat in het menselijk mucosale longweefsel wonen bevatten. Bovendien zijn de protocollen zijn ook direct van toepassing op monsters verkregen van patiënten die lijden aan pulmonaire ziekten waarbij bronchoscopie hoort bij stellen van de diagnose, zoals chronische obstructieve longziekte (COPD), sarcoïdose, of longkanker.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit document beschrijft hoe u een gedetailleerde ruimtelijke en fenotypische karakterisatie van longweefsel-ingezeten DCs bij gezonde mensen te genereren met behulp van immunohistochemie en flowcytometrie op endobronchiale mucosale biopten tijdens bronchoscopie verzameld. In de volgende paragrafen kritische stappen in het protocol worden in detail besproken.
Kritische Stappen met het Protocol
Snijden en immunohistochemie: Het is cruciaal om de biopsie blokken bij -2…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen graag de vrijwilligers die klinisch materiaal hebben bijgedragen aan dit onderzoek bedanken. We zijn ook dankbaar voor het personeel van het ministerie van Volksgezondheid en Clinical Medicine, Division of Medicine / Respiratory Medicine, University Hospital, Umeå (Norrlands universitetssjukhus) voor het verzamelen van alle klinische materiaal.
Dit werk werd ondersteund door subsidies aan AS-S van de Zweedse Research Council, de Zweedse Hart-Lung Foundation, de Zweedse Stichting voor Strategische Research, en het Karolinska Institutet.
Materials
| Bronchoscopy | |||
| Bronchoscope BF1T160 | Olympus | BF1T160 | |
| Light source | Olympus | Exera CV-160 | |
| Fenestrated forceps | Olympus | FB21C | Used to take biopsies |
| Bite Block | Conmed | 1429 | 20x27mm |
| Glucose 25% | 500mL intravenous | ||
| Glycopyrronium bromide 0.2mg/mL | Intravenous. Prevents mucus/saliva secretion | ||
| Mixt. Midazolam 1mg/mL p.o | Can be used for extra relaxation | ||
| Lidocaine, 40mg/mL | Mouth and throat administration / Gargled | ||
| Lidocaine 100mg/ml spray | Administered to back of throat | ||
| Lidocaine 20mg/ml spray | Administered via bronchoscope to airways | ||
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| GMA processing and embedding | |||
| Glass vials | 5mL | ||
| Acetone | Sigma-Aldrich | 32201-1L | |
| Molecular sieves, 4A | Alfa Aesar | 88120 | 3-4mm diameter pellets |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride | Sigma-Aldrich | P-7626 | 0.035g/100ml acetone |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | I-6125 | 0.37g/100ml acetone |
| Polythene-flat TAAB embedding capsules | TAAB laboratories | C094 | x500 8mm diameter, polythene, flat-bottom capsules |
| Capsule holder | TAAB laboratories | C054 | Holds 25 8mm capsules |
| JB-4 GMA embedding kit | Polysciences | 00226 | Contains JB-4 Solution A (0026A-800), JB-4 solution B (0026B-3.8), benzoyl peroxide (02618-12) |
| Methyl benzoate | Sigma-Aldrich | 27614-1L | |
| Silica gel with humidity indicator | Scharlau | GE0043 | 2.5-6mm |
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| GMA sectioning | |||
| Glass microscope slides | ThermoFisher Scientific | 10143562CEF | Cut edges, frosted end |
| Poly-L-Lysine solution | Sigma-Aldrich | P8920-500mL | 1:10 for working solution |
| Sheet glass strips for ultramicrotomy | Alkar | ||
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P2287 | Wash solution (0.1% Tween20) |
| LKB 7800B Knifemaker | LKB | ||
| Capsule splitter | TAAB laboratories | C065 | |
| Carbon steel single edge blades | TAAB laboratories | B054 | |
| Vice | |||
| Ammonia, 25% | VWR | 1133.1000 | 2mL in 1L, 1:500 (0.05%) |
| Microtome | Leica | Leica RM 2165 | |
| Light source | Leica | Leica CLS 150 XE | |
| Microscope with swing arm stand | Leica | Leica MZ6 | |
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| GMA Immunohistochemistry | |||
| Diamond tipped pen | Histolab | 5218 | |
| Hydrogen peroxide 30% solution | AnalaR Normapur | 23619.264 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S8032 | |
| Tris | Roche | 10708976001 | |
| Sodium chloride | VWR chemicals | 27810.295 | |
| Bovine serum albumin | Millipore | 82-045-2 | Probumin BSA diagnostic grade |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5546 | |
| Anti-human CD45 antibody | BioLegend | 304002 | Mouse monoclonal, clone HI30, isotype IgG1k. Working concentration of 500 ng/ml |
| Anti-human CD1a antibody | AbD Serotech | MCA80GA | Mouse monoclonal, clone NA1/34-HLK, isotype IgG2a. Working concentration of 10 µg/ml |
| Mouse monoclonal IgG1 isotype control | Abcam | ab27479 | |
| Mouse monoclonal IgG2a isotype control | Dako | X094301-2 | |
| Vectastain ABC Elite standard kit | Vector Labs | PK-6100 | |
| AEC (3-amino-9-ethylcarbazole) peroxidase substrate kite | Vector Labs | SK-4200 | |
| Mayers haematoxylin | HistoLab | 01820 | |
| Permanent Aqueous Mounting Medium | AbD Serotech | BUF058C | |
| Drying oven | |||
| DPX permanent mounting solution | VWR | 360292F | |
| Light microscope | Leica | Leica DMLB | |
| Microscope camera | Leica | Leica DFC 320 | |
| Analysis software | Leica | Leica Qwin V3 | |
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Enzymatic digestion | |||
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Sigma-Aldrich | 55021C | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | DTT-RO | |
| Collagenase II | Sigma-Aldrich | C6885 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | 10104159001 ROCHE | |
| RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| Forceps | |||
| Platform rocker | Grant instruments | PMR-30 | |
| 50 mL conical tubes | Falcon | 14-432-22 | |
| 40 µm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Flow cytometry | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | |||
| LIVE/DEAD Aqua fixable dead cell stain kit | Life Technologies | L34957 | |
| CD45 | BD | 555485 | |
| CD3 | BD | 557757 | |
| CD20 | BD | 335829 | |
| CD56 | Biolegend | 318332 | |
| CD66abce | Miltenyi | 130-101-132 | |
| HLA-DR | BD | 555813 | |
| CD14 | BD | 557831 | |
| CD16 | Biolegend | 302026 | |
| CD11c | BD | 560369 | |
| CD1c | Miltenyi | 130-098-009 | |
| CD141 | Miltenyi | 130-090-514 | |
| CD103 | Biolegend | 350212 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| LSR II Flow cytometer | BD | Flow cytometer | |
| FlowJo | FlowJo | Software for analysis |
Referenzen
- Kopf, M., Schneider, C., Nobs, S. P. The development and function of lung-resident macrophages and dendritic cells. Nat Immunol. 16 (1), 36-44 (2015).
- Condon, T. V., Sawyer, R. T., Fenton, M. J., Riches, D. W. Lung dendritic cells at the innate-adaptive immune interface. J Leukoc Biol. 90 (5), 883-895 (2011).
- Lambrecht, B. N., Hammad, H. Biology of lung dendritic cells at the origin of asthma. Immunity. 31 (3), 412-424 (2009).
- Schlitzer, A., McGovern, N., Ginhoux, F. Dendritic cells and monocyte-derived cells: Two complementary and integrated functional systems. Semin Cell Dev Biol. 41, 9-22 (2015).
- Ziegler-Heitbrock, L., et al. Nomenclature of monocytes and dendritic cells in blood. Blood. 116 (16), e74-e80 (2010).
- Demedts, I. K., Brusselle, G. G., Vermaelen, K. Y., Pauwels, R. A. Identification and characterization of human pulmonary dendritic cells. Am J Respir Cell Mol Biol. 32 (3), 177-184 (2005).
- Donnenberg, V. S., Donnenberg, A. D. Identification rare-event detection and analysis of dendritic cell subsets in broncho-alveolar lavage fluid and peripheral blood by flow cytometry. Front Biosci. 8, s1175-s1180 (2003).
- Masten, B. J., et al. Characterization of myeloid and plasmacytoid dendritic cells in human lung. J Immunol. 177 (11), 7784-7793 (2006).
- Ten Berge, B., et al. A novel method for isolating dendritic cells from human bronchoalveolar lavage fluid. J Immunol Methods. 351 (1-2), 13-23 (2009).
- Yu, C. I., et al. Human CD1c+ dendritic cells drive the differentiation of CD103+ CD8+ mucosal effector T cells via the cytokine TGF-beta. Immunity. 38 (4), 818-830 (2013).
- Nicod, L. P., Lipscomb, M. F., Toews, G. B., Weissler, J. C. Separation of potent and poorly functional human lung accessory cells based on autofluorescence. J Leukoc Biol. 45 (5), 458-465 (1989).
- Sertl, K., et al. Dendritic cells with antigen-presenting capability reside in airway epithelium, lung parenchyma, and visceral pleura. J Exp Med. 163 (2), 436-451 (1986).
- van Haarst, J. M., de Wit, H. J., Drexhage, H. A., Hoogsteden, H. C. Distribution and immunophenotype of mononuclear phagocytes and dendritic cells in the human lung. Am J Respir Cell Mol Biol. 10 (5), 487-492 (1994).
- Schlitzer, A., et al. IRF4 transcription factor-dependent CD11b+ dendritic cells in human and mouse control mucosal IL-17 cytokine responses. Immunity. 38 (5), 970-983 (2013).
- Yu, Y. A., et al. Flow Cytometric Analysis of Myeloid Cells in Human Blood, Bronchoalveolar Lavage, and Lung Tissues. Am J Respir Cell Mol Biol. , (2015).
- Haniffa, M., et al. Human tissues contain CD141hi cross-presenting dendritic cells with functional homology to mouse CD103+ nonlymphoid dendritic cells. Immunity. 37 (1), 60-73 (2012).
- Britten, K. M., Howarth, P. H., Roche, W. R. Immunohistochemistry on resin sections: a comparison of resin embedding techniques for small mucosal biopsies. Biotech Histochem. 68 (5), 271-280 (1993).
- Perfetto, S. P., Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. Seventeen-colour flow cytometry: unravelling the immune system. Nat Rev Immunol. 4 (8), 648-655 (2004).
- Baharom, F., et al. Dendritic Cells and Monocytes with Distinct Inflammatory Responses Reside in Lung Mucosa of Healthy Humans. J Immunol. 196 (11), 4498-4509 (2016).
- Salvi, S., et al. Acute inflammatory responses in the airways and peripheral blood after short-term exposure to diesel exhaust in healthy human volunteers. Am J Respir Crit Care Med. 159 (3), 702-709 (1999).
- Schon-Hegrad, M. A., Oliver, J., McMenamin, P. G., Holt, P. G. Studies on the density, distribution, and surface phenotype of intraepithelial class II major histocompatibility complex antigen (Ia)-bearing dendritic cells (DC) in the conducting airways. J Exp Med. 173 (6), 1345-1356 (1991).
- Saeys, Y., Gassen, S. V., Lambrecht, B. N. Computational flow cytometry: helping to make sense of high-dimensional immunology data. Nat Rev Immunol. 16 (7), 449-462 (2016).
