Cellule umane del polmone dendritiche: distribuzione spaziale e fenotipica di identificazione in endobronchiale biopsie utilizzando l'immunoistochimica e citometria a flusso
Summary
Lung-resident immune cells, including dendritic cells (DCs) in humans, are critical for defense against inhaled pathogens and allergens. However, due to the scarcity of human lung tissue, studies are limited. This work presents protocols to process human mucosal endobronchial biopsies for studying lung DCs using immunohistochemistry and flow cytometry.
Abstract
The lungs are constantly exposed to the external environment, which in addition to harmless particles, also contains pathogens, allergens, and toxins. In order to maintain tolerance or to induce an immune response, the immune system must appropriately handle inhaled antigens. Lung dendritic cells (DCs) are essential in maintaining a delicate balance to initiate immunity when required without causing collateral damage to the lungs due to an exaggerated inflammatory response. While there is a detailed understanding of the phenotype and function of immune cells such as DCs in human blood, the knowledge of these cells in less accessible tissues, such as the lungs, is much more limited, since studies of human lung tissue samples, especially from healthy individuals, are scarce. This work presents a strategy to generate detailed spatial and phenotypic characterization of lung tissue resident DCs in healthy humans that undergo a bronchoscopy for the sampling of endobronchial biopsies. Several small biopsies can be collected from each individual and can be subsequently embedded for ultrafine sectioning or enzymatically digested for advanced flow cytometric analysis. The outlined protocols have been optimized to yield maximum information from small tissue samples that, under steady-state conditions, contain only a low frequency of DCs. While the present work focuses on DCs, the methods described can directly be expanded to include other (immune) cells of interest found in mucosal lung tissue. Furthermore, the protocols are also directly applicable to samples obtained from patients suffering from pulmonary diseases where bronchoscopy is part of establishing the diagnosis, such as chronic obstructive pulmonary disease (COPD), sarcoidosis, or lung cancer.
Introduction
I polmoni sono in continuo contatto con l'ambiente esterno e sono esposti a entrambe le particelle innocue e microbi con la capacità di causare la malattia. Pertanto, è fondamentale per il sistema immunitario di montare potenti risposte immunitarie contro patogeni, ma è altrettanto importante mantenere la tolleranza agli antigeni inalati che non causano malattie. Per fornire potenti sorveglianza immunitaria, il sistema respiratorio è fiancheggiata da una rete di cellule del sistema immunitario, comprese le cellule dendritiche (DC). DC sono cellule professionali presentanti l'antigene con la capacità unica di attivare le cellule T naive. In polmoni umani, DC residenti incontrano un antigene e poi processo e trasportano ai linfonodi polmonari drenanti per presentazione e l'attivazione delle cellule T 1, 2, 3.
Nel sistema immunitario umano, DC può essere suddiviso in più sottoinsiemi, con distinct ma sovrapposte funzioni: CD1c + e CD141 + DC mieloidi (MDC) e CD123 + cellule dendritiche plasmacitoidi (PDC) 4, 5. Mentre la maggior parte conoscenza dettagliata sulle DC umana deriva da studi di sangue, è ormai evidente che i polmoni umani porto anche rare popolazioni di sottoinsiemi DC con cellule T capacità stimolante 6, 7, 8, 9. Tuttavia, i dati accumulati dimostrano che le cellule immunitarie, tra DC, differiscono nella loro frequenza, fenotipo e funzione a seconda della loro posizione anatomica 10. Pertanto, è importante studiare le cellule immunitarie dal tessuto rilevante per comprendere il loro contributo alla immunità locale e tolleranza. Nel loro insieme, questo sottolinea la necessità di studiare DC polmone residente al momento di affrontare le malattie polmonari, nonostante DC sangue che viene più facilmente disponibili e accessibili nell'uomo.
I primi studi che hanno indagato DC polmonari residente nell'uomo utilizzassero principalmente morfologia e l'espressione dei singoli marcatori, come HLA-DR e CD11c, in sezioni di tessuto usando immunoistochimica 11, 12, 13. Al contrario, studi più recenti hanno di solito fatto affidamento su analisi di citometria di flusso per studiare diversi sottoinsiemi di cellule immunitarie. Tuttavia, poiché è difficile trovare un singolo marker superficie cellulare che identifica univocamente uno specifico sottoinsieme DC, il potenziale limitazione di studi applicando citofluorimetria solo quattro colori è il rischio di inclusione popolazioni cellulari con marcatori fenotipici simili come DC. Ad esempio, CD11c è espresso su tutte DC mieloidi e la stragrande maggioranza dei monociti. D'altra parte, negli studi di applicazione di pannelli più avanzati citometria di flusso, tessuto polmonare non-cancerose da resezioni chirurgiche di pazienti sono stati in genere utilizzatoxref "> 10, 14, 15, 16, anche se non è chiaro se queste popolazioni rare sono veramente rappresentativi delle DC presente in soggetti sani. Nel complesso, gli studi sono limitati in gran parte dovuto al fatto che rimosso chirurgicamente o tutto il tessuto polmonare umano è scarso.
Per superare alcune di queste limitazioni, questo lavoro descrive come eseguire una dettagliata analisi della distribuzione spaziale e l'identificazione fenotipica delle DC in biopsie endobronchiali mucosa ottenuti da volontari sani che si sottopongono a una broncoscopia. Diversi piccoli biopsie possono essere raccolti da ogni individuo e possono essere successivamente integrati per il sezionamento e l'analisi mediante immunoistochimica o enzimaticamente digerito per analisi avanzata citometria a flusso. Usando tessuto polmonare in forma di biopsie endobronchiali ottenuti broncoscopie conferisce il vantaggio di rendere possibile l'esecuzione della study su volontari sani, a differenza chirurgia aperta dei polmoni che, per ovvi motivi, è limitata a pazienti che necessitano di chirurgia toracica. Inoltre, il tessuto che viene campionata durante una broncoscopia da volontari sani è fisiologicamente normale, in contrasto ad una zona non interessata del tessuto polmonare in pazienti con malattia polmonare. D'altra parte, le biopsie sono piccole e il numero di cellule recuperate, anche quando il pool diverse biopsie, limita il tipo di analisi che possono essere eseguite.
Mentre il presente lavoro si concentra sulla DC, i metodi descritti può essere ampliato per includere direttamente altre cellule del sistema immunitario () di interesse che si trovano nel tessuto mucoso polmone umano. Inoltre, i protocolli sono direttamente applicabili ai campioni ottenuti da pazienti affetti da malattie polmonari dove broncoscopia fa parte di stabilire la diagnosi, come la malattia cronica ostruttiva (BPCO), sarcoidosi, o il cancro ai polmoni.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo documento descrive come generare una caratterizzazione spaziale e fenotipica dettagliata del polmone DC tessuti residenti negli esseri umani sani utilizzando immunoistochimica e citometria a flusso su biopsie della mucosa endobronchiali raccolti durante la broncoscopia. Nei paragrafi seguenti passaggi critici nel protocollo sono discusse in dettaglio.
I passaggi critici con il protocollo
Sezionamento e immunoistochimica: E 'fondamentale per mantenere i bl…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare i volontari che hanno contribuito materiale clinico a questo studio. Siamo anche grati al personale presso il Dipartimento di Sanità Pubblica e Medicina Clinica, Divisione di Medicina / Medicina Respiratoria, Ospedale Universitario, Umeå (Norrlands Universitetssjukhus) per la raccolta di tutto il materiale clinico.
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni a AS-S dal Consiglio svedese della ricerca, la Fondazione svedese cuore-polmone, la Fondazione svedese per la ricerca strategica, e il Karolinska Institutet.
Materials
| Bronchoscopy | |||
| Bronchoscope BF1T160 | Olympus | BF1T160 | |
| Light source | Olympus | Exera CV-160 | |
| Fenestrated forceps | Olympus | FB21C | Used to take biopsies |
| Bite Block | Conmed | 1429 | 20x27mm |
| Glucose 25% | 500mL intravenous | ||
| Glycopyrronium bromide 0.2mg/mL | Intravenous. Prevents mucus/saliva secretion | ||
| Mixt. Midazolam 1mg/mL p.o | Can be used for extra relaxation | ||
| Lidocaine, 40mg/mL | Mouth and throat administration / Gargled | ||
| Lidocaine 100mg/ml spray | Administered to back of throat | ||
| Lidocaine 20mg/ml spray | Administered via bronchoscope to airways | ||
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| GMA processing and embedding | |||
| Glass vials | 5mL | ||
| Acetone | Sigma-Aldrich | 32201-1L | |
| Molecular sieves, 4A | Alfa Aesar | 88120 | 3-4mm diameter pellets |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride | Sigma-Aldrich | P-7626 | 0.035g/100ml acetone |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | I-6125 | 0.37g/100ml acetone |
| Polythene-flat TAAB embedding capsules | TAAB laboratories | C094 | x500 8mm diameter, polythene, flat-bottom capsules |
| Capsule holder | TAAB laboratories | C054 | Holds 25 8mm capsules |
| JB-4 GMA embedding kit | Polysciences | 00226 | Contains JB-4 Solution A (0026A-800), JB-4 solution B (0026B-3.8), benzoyl peroxide (02618-12) |
| Methyl benzoate | Sigma-Aldrich | 27614-1L | |
| Silica gel with humidity indicator | Scharlau | GE0043 | 2.5-6mm |
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| GMA sectioning | |||
| Glass microscope slides | ThermoFisher Scientific | 10143562CEF | Cut edges, frosted end |
| Poly-L-Lysine solution | Sigma-Aldrich | P8920-500mL | 1:10 for working solution |
| Sheet glass strips for ultramicrotomy | Alkar | ||
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P2287 | Wash solution (0.1% Tween20) |
| LKB 7800B Knifemaker | LKB | ||
| Capsule splitter | TAAB laboratories | C065 | |
| Carbon steel single edge blades | TAAB laboratories | B054 | |
| Vice | |||
| Ammonia, 25% | VWR | 1133.1000 | 2mL in 1L, 1:500 (0.05%) |
| Microtome | Leica | Leica RM 2165 | |
| Light source | Leica | Leica CLS 150 XE | |
| Microscope with swing arm stand | Leica | Leica MZ6 | |
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| GMA Immunohistochemistry | |||
| Diamond tipped pen | Histolab | 5218 | |
| Hydrogen peroxide 30% solution | AnalaR Normapur | 23619.264 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S8032 | |
| Tris | Roche | 10708976001 | |
| Sodium chloride | VWR chemicals | 27810.295 | |
| Bovine serum albumin | Millipore | 82-045-2 | Probumin BSA diagnostic grade |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5546 | |
| Anti-human CD45 antibody | BioLegend | 304002 | Mouse monoclonal, clone HI30, isotype IgG1k. Working concentration of 500 ng/ml |
| Anti-human CD1a antibody | AbD Serotech | MCA80GA | Mouse monoclonal, clone NA1/34-HLK, isotype IgG2a. Working concentration of 10 µg/ml |
| Mouse monoclonal IgG1 isotype control | Abcam | ab27479 | |
| Mouse monoclonal IgG2a isotype control | Dako | X094301-2 | |
| Vectastain ABC Elite standard kit | Vector Labs | PK-6100 | |
| AEC (3-amino-9-ethylcarbazole) peroxidase substrate kite | Vector Labs | SK-4200 | |
| Mayers haematoxylin | HistoLab | 01820 | |
| Permanent Aqueous Mounting Medium | AbD Serotech | BUF058C | |
| Drying oven | |||
| DPX permanent mounting solution | VWR | 360292F | |
| Light microscope | Leica | Leica DMLB | |
| Microscope camera | Leica | Leica DFC 320 | |
| Analysis software | Leica | Leica Qwin V3 | |
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Enzymatic digestion | |||
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Sigma-Aldrich | 55021C | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | DTT-RO | |
| Collagenase II | Sigma-Aldrich | C6885 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | 10104159001 ROCHE | |
| RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| Forceps | |||
| Platform rocker | Grant instruments | PMR-30 | |
| 50 mL conical tubes | Falcon | 14-432-22 | |
| 40 µm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Flow cytometry | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | |||
| LIVE/DEAD Aqua fixable dead cell stain kit | Life Technologies | L34957 | |
| CD45 | BD | 555485 | |
| CD3 | BD | 557757 | |
| CD20 | BD | 335829 | |
| CD56 | Biolegend | 318332 | |
| CD66abce | Miltenyi | 130-101-132 | |
| HLA-DR | BD | 555813 | |
| CD14 | BD | 557831 | |
| CD16 | Biolegend | 302026 | |
| CD11c | BD | 560369 | |
| CD1c | Miltenyi | 130-098-009 | |
| CD141 | Miltenyi | 130-090-514 | |
| CD103 | Biolegend | 350212 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| LSR II Flow cytometer | BD | Flow cytometer | |
| FlowJo | FlowJo | Software for analysis |
Referenzen
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