La stimolazione di Notch segnalazione in mouse osteoclasti Precursori

Summary

Notch signaling is a form of cellular communication that relies upon direct contact between cells. To properly induce Notch signaling in vitro, Notch ligands must be presented to cells in an immobilized state. This protocol describes methods for in vitro stimulation of Notch signaling in mouse osteoclast precursors.

Abstract

Notch signaling is a key component of multiple physiological and pathological processes. The nature of Notch signaling, however, makes in vitro investigation of its varying and sometimes contradictory roles a challenge. As a component of direct cell-cell communication with both receptors and ligands bound to the plasma membrane, Notch signaling cannot be activated in vitro by simple addition of ligands to culture media, as is possible with many other signaling pathways. Instead, Notch ligands must be presented to cells in an immobilized state.

Variations in methods of Notch signaling activation can lead to different outcomes in cultured cells. In osteoclast precursors, in particular, differences in methods of Notch stimulation and osteoclast precursor culture and differentiation have led to disagreement over whether Notch signaling is a positive or negative regulator of osteoclast differentiation. While closer comparisons of osteoclast differentiation under different Notch stimulation conditions in vitro and genetic models have largely resolved the controversy regarding Notch signaling and osteoclasts, standardized methods of continuous and temporary stimulation of Notch signaling in cultured cells could prevent such discrepancies in the future.

This protocol describes two methods for stimulating Notch signaling specifically in cultured mouse osteoclast precursors, though these methods should be applicable to any adherent cell type with minor adjustments. The first method produces continuous stimulation of Notch signaling and involves immobilizing Notch ligand to a tissue culture surface prior to the seeding of cells. The second, which uses Notch ligand bound to agarose beads allows for temporary stimulation of Notch signaling in cells that are already adhered to a culture surface. This protocol also includes methods for detecting Notch activation in osteoclast precursors as well as representative transcriptional markers of Notch signaling activation.

Introduction

Il percorso di segnalazione Notch dei mammiferi è omologa alla stessa via in Drosophila melanogaster e si compone di quattro recettori transmembrana Notch (Notch1-4) e cinque ligandi di membrana della Jagged (JAG1 & JAG2) e Delta-like (DLL1, 3, e 4) le famiglie ^1. Notch viene avviata quando il recettore Notch su una cellula ricevente è vincolato da ligando su una cella di trasmissione ^2. Nel corso di questo trans-attivazione, il Notch ligando legato alla membrana produce una forza che si estende sul Notch recettore di membrana ^{3, 4.} La forza di stiramento del ligando di legame induce cambiamenti conformazionali del recettore Notch che facilitano scissione extracellulare del recettore da TNFalfa enzima di conversione (TACE) seguito da un evento clivaggio intracellulare mediato da un gamma-secretasi complesso (γ-secretasi) presenilina-contenenti. γ-secretasi rilascia la int Notchdominio racellular (NiCd), che trasloca nel nucleo dove forma un complesso trascrizionale con CBF-1-Su (H) -Lag-1 (CSL), mente-like (MAML), e fattori specifici tipo di cellula a guidare l'espressione di geni bersaglio ^5.

Gli elementi meccanici di risultato di attivazione del segnale di Notch nella necessità di metodi unici di attivazione Notch percorso in vitro. leganti Notch solubili possono legarsi ai recettori Notch, ma non riescono a produrre estende forze necessarie per il rilascio NiCd mentre allo stesso tempo inibizione competitiva del legame di ligandi Notch associati alle cellule. Così, l'aggiunta di ligandi solubili Notch a mezzo di coltura può attenuare Notch normale segnalazione ^{6, 7.} Fortunatamente, leganti Notch possono indurre liberazione NICD se sono fissati ad un substrato adeguatamente rigida ^{5, 8, 9,10.} Semina cellule su substrati di coltura ligando rivestite o l'applicazione di perline ligando rivestite di cellule in grado di attivare sia segnale di Notch, e la scelta tra i due dipende in primo luogo la tempistica desiderata della stimolazione Notch. Infatti, l'attivazione di Notch immediata temporanea, come sarebbe desiderato durante il punto medio di un saggio funzionale o differenziazione, Notch ligando può essere associato a agarosio perline, applicati alle cellule in coltura, e lavato in qualsiasi momento. Per ulteriori Notch sostenuta dall'inizio di un periodo di coltura, piastre di coltura di tessuto possono essere rivestiti con legante prima della semina cellulare.

Ai fini di questo protocollo, i metodi vengono effettuati utilizzando il mouse precursori degli osteoclasti, ma i metodi e le variazioni sui metodi qui descritti sono applicabili ad un'ampia varietà di tipi cellulari ^{6, 11, 12, 13,} </sup> ^14. Gli osteoclasti sono cellule terminalmente differenziate Linage ematopoietiche che sono responsabili per il riassorbimento del tessuto osseo, e sono implicati in molteplici disturbi della perdita di massa ossea ^15. Così, studio in vitro della differenziazione degli osteoclasti dai loro precursori monociti / macrofagi lignaggio e dei meccanismi molecolari che controllano la loro funzione è essenziale per una migliore comprensione degli osteoclasti e sviluppo di nuove terapie osso-rigenerante. Mentre è ormai generalmente accettato che la segnalazione Notch gioca un ruolo positivo nella differenziazione e la funzione degli osteoclasti, variazioni sia la stimolazione di Notch e osteoclasti cultura precursore e la differenziazione ha portato a risultati contraddittori inizialmente ^{16, 17, 18, 19.} Un esame più attento delle differenze nei metodi e l'uso di geneticamodelli sono notevolmente chiarito il ruolo della segnalazione Notch in osteoclastogenesis, ma l'applicazione di metodi di stimolazione e cultura Notch standardizzati potrebbero impedire tali controversie in studi futuri di segnalazione di Notch in altri tipi cellulari ^{20, 21, 22, 23.}

Esistono diversi metodi per la coltura e differenziare precursori del mouse osteoclasti, e, come con vari metodi per stimolare segnalazione Notch, il metodo migliore dipenderà dalla domanda sperimentale. Qui, sarà presentato il nostro metodo preferito di coltura frazioni aderenti e non aderenti di cellule di midollo lavata dalle ossa lunghe del mouse. Questo metodo ha il vantaggio di richiedere essenzialmente alcun attrezzature specializzate e produrre cellule che sono applicabili ad una varietà di metodi di differenziazione.

Protocol

Tutte le ricerche sugli animali vertebrati è stata eseguita in conformità con i protocolli approvati dalla University of Pennsylvania Istituzionale cura degli animali e del Comitato uso (IACUC). 1. Culture Media Preparazione Preparare α-MEM sciogliendo medium (MEM) in polvere essenziale minimo e 1,9 g di bicarbonato di sodio in 900 ml di H 2 O e integrare con 2 mM L-glutammina, 100 unità / ml di penicillina, 100 ug / ml di streptomicina e 100 ml calore siero fetale …

Representative Results

Lo scopo di questo metodo è quello della cultura e stimolare segnale di Notch in precursori degli osteoclasti. Se correttamente colto, precursori degli osteoclasti presentano una morfologia a forma di fuso principalmente allungata con citoplasma liscia (Figura 1A). Si deve prestare attenzione per evitare l'attivazione immunologica dei precursori degli osteoclasti. Dopo l'attivazione, precursori diffondono e diventano appiattito con schiuma citoplasma (Fi…

Discussion

Passaggi critici all'interno del protocollo

Cultura e nella differenziazione in vitro dei precursori degli osteoclasti fornisce una piattaforma utile per l'indagine dei meccanismi molecolari di osteoclastogenesi e l'identificazione di bersagli terapeutici per la rigenerazione ossea e la conservazione della massa ossea. Quando la coltura precursori degli osteoclasti del mouse, l'elemento più critico è la manutenzione dei precursori in uno stato ingenuo. Come m…

Materials

Recombinant mouse M-CSF	Biolegend	576402	Available from multiple suppliers, test activity before experiments
Recombinant mouse RANKL	Shenandoah Biotechnology	200-04	Available from multiple suppliers, test activity before experiments
Recombinant human Jagged1-Fc	R&D Systems	1277-JG-050	Available from multiple suppliers, test activity before experiments
Protein G agarose beads	InvivoGen	gel-agg-2
Goat anti-human IgG Fc	Jackson ImmunoResearch	109-001-008
Minimum Essential Medium powder	Sigma-Aldrich	M0894
Accutase cell dissociation reagent	ThermoFisher	A1110501	Used to lift osteoclast precursors
Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit	Sigma-Aldrich	387A-1KT	Used to stain differentiated osteoclasts