La estimulación de la señalización de Notch en el ratón osteoclastos precursores

Summary

Notch signaling is a form of cellular communication that relies upon direct contact between cells. To properly induce Notch signaling in vitro, Notch ligands must be presented to cells in an immobilized state. This protocol describes methods for in vitro stimulation of Notch signaling in mouse osteoclast precursors.

Abstract

Notch signaling is a key component of multiple physiological and pathological processes. The nature of Notch signaling, however, makes in vitro investigation of its varying and sometimes contradictory roles a challenge. As a component of direct cell-cell communication with both receptors and ligands bound to the plasma membrane, Notch signaling cannot be activated in vitro by simple addition of ligands to culture media, as is possible with many other signaling pathways. Instead, Notch ligands must be presented to cells in an immobilized state.

Variations in methods of Notch signaling activation can lead to different outcomes in cultured cells. In osteoclast precursors, in particular, differences in methods of Notch stimulation and osteoclast precursor culture and differentiation have led to disagreement over whether Notch signaling is a positive or negative regulator of osteoclast differentiation. While closer comparisons of osteoclast differentiation under different Notch stimulation conditions in vitro and genetic models have largely resolved the controversy regarding Notch signaling and osteoclasts, standardized methods of continuous and temporary stimulation of Notch signaling in cultured cells could prevent such discrepancies in the future.

This protocol describes two methods for stimulating Notch signaling specifically in cultured mouse osteoclast precursors, though these methods should be applicable to any adherent cell type with minor adjustments. The first method produces continuous stimulation of Notch signaling and involves immobilizing Notch ligand to a tissue culture surface prior to the seeding of cells. The second, which uses Notch ligand bound to agarose beads allows for temporary stimulation of Notch signaling in cells that are already adhered to a culture surface. This protocol also includes methods for detecting Notch activation in osteoclast precursors as well as representative transcriptional markers of Notch signaling activation.

Introduction

La vía de señalización Notch de mamífero es homóloga a la misma vía en Drosophila melanogaster y consta de cuatro receptores transmembrana muesca (Notch1-4) y cinco ligandos unidos a la membrana del Jagged (JAG1 y JAG2) y Delta-como (DLL1, 3, y 4) las familias ^1. La señalización de Notch se inicia cuando el receptor Notch en una célula receptora está obligado por ligando en una célula de transmisión ^2. Durante este trans-activación, el ligando Notch unida a la membrana produce una fuerza de estiramiento sobre el receptor Notch unida a la membrana ^{3, 4.} La fuerza de estiramiento de ligando de unión induce cambios conformacionales en el receptor Notch que facilitan la escisión extracelular del receptor de TNF por la enzima de conversión (TACE), seguido de un evento de escisión intracelular mediada por una gamma-secretasa complejo (γ-secretasa) que contiene la presenilina. comunicados de γ-secretasa la int Notchdominio racellular (NICD), que se transloca al núcleo donde se forma un complejo de activación de la transcripción con CBF-1-Su (H) -Lag-1 (CSL), mastermind-como (MAML), y los factores específicos del tipo de células para dirigir la expresión de los genes objetivo ^5.

Los elementos mecánicos del resultado de la activación de la señalización de Notch en la necesidad de métodos únicos de activación de la vía de Notch in vitro. ligandos Notch solubles pueden unirse a Notch receptores, pero no producir fuerzas de estiramiento necesarias para la liberación NICD mientras que al mismo tiempo competitivamente inhibir la unión de ligandos de Notch asociados a células. Por lo tanto, la adición de ligandos de Notch solubles al medio de cultivo puede atenuar normal de señalización ^{6, 7} Notch. Afortunadamente, los ligandos de Notch pueden inducir la liberación de NICD si se fijan a un sustrato rígido apropiado ^{5, 8, 9,10.} La siembra de células sobre sustratos de cultivo ligando recubiertos o la aplicación de perlas de ligando recubierto a las células puede tanto activar la señalización de Notch, y la elección entre ellos depende principalmente de la temporización deseada de estimulación Notch. Para la activación de señalización Notch inmediata y temporal, como sería deseado durante el punto medio de un ensayo funcional o la diferenciación, el ligando de Notch se puede unir a perlas de agarosa, aplicados a las células cultivadas, y se lavó a cabo en cualquier momento. Para obtener más señalización Notch sostenido desde el comienzo de un periodo de cultivo, placas de cultivo de tejido se pueden recubrir con el ligando antes de la siembra de células.

Para los fines de este protocolo, los métodos se llevan a cabo utilizando precursores de osteoclastos de ratón, pero los métodos y variaciones de los métodos descritos aquí son aplicables a una amplia variedad de tipos de células ^{6, 11, 12, 13,} </sup> ^14. Los osteoclastos son células terminalmente diferenciadas linage hematopoyéticas que son responsables de la resorción del tejido óseo, y que están implicadas en varios trastornos de pérdida ósea ^15. Por lo tanto, en el estudio in vitro de la diferenciación de los osteoclastos a partir de sus precursores de monocitos / macrófagos linaje y los mecanismos moleculares que controlan su función es esencial para la mejor comprensión de los osteoclastos y desarrollo de nuevas terapias de regeneración de hueso. A pesar de que ahora se acepta generalmente que la señalización Notch desempeña un papel positivo en la diferenciación y función de los osteoclastos, las variaciones en la estimulación tanto de señalización Notch y la cultura de los osteoclastos precursores y la diferenciación condujeron a resultados contradictorios inicialmente ^{16, 17, 18, 19.} Un examen más detallado de las diferencias en los métodos y el uso de los recursos genéticosmodelos han aclarado en gran medida el papel de la señalización Notch en la osteoclastogénesis, pero la aplicación de métodos de estimulación y cultura Notch estandarizados podrían prevenir este tipo de controversias en futuros estudios de señalización Notch en otros tipos de células ^{20, 21, 22, 23.}

Existen múltiples métodos para el cultivo y la diferenciación de precursores de osteoclastos de ratón, y, como con diferentes métodos para estimular la señalización de Notch, el mejor método dependerá de la pregunta experimental. En este documento, se presentará nuestro método preferido de cultivo fracciones adherentes y no adherentes de células de la médula ELIMINADOS de los huesos largos del ratón. Este método tiene la ventaja de requerir esencialmente ningún equipo especializado y la producción de células que son aplicables a una variedad de métodos de diferenciación.

Protocol

Toda la investigación con animales vertebrados que se llevó a cabo de acuerdo con los protocolos aprobados por la Universidad de Pennsylvania Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comisión (IACUC). 1. Medios de cultivo Preparación Preparar α-MEM disolviendo medio polvo mínimo esencial (MEM) y 1,9 g de bicarbonato de sodio en 900 ml de H2O y complementar con 2 mM L-glutamina, 100 unidades / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina y 100 ml calor suer…

Representative Results

El objetivo de este método es que la cultura y estimular la señalización Notch en los precursores de osteoclastos. Cuando está debidamente cultivadas, precursores de osteoclastos exhiben una morfología en forma de huso principalmente alargada con citoplasma lisa (Figura 1A). Se debe tener cuidado para evitar la activación inmunológica de los precursores de osteoclastos. Tras la activación, los precursores extienden y se aplanan con espumosa citoplasma (Fi…

Discussion

Los pasos críticos en el protocolo

Cultura y en la diferenciación in vitro de los precursores de osteoclastos proporciona una plataforma útil para la investigación de los mecanismos moleculares de la osteoclastogénesis y la identificación de dianas terapéuticas para la regeneración ósea y la conservación de la masa ósea. Cuando el cultivo de precursores de osteoclastos de ratón, el elemento más crítico es el mantenimiento de los precursores en un estado ingenuo. …

Materials

Recombinant mouse M-CSF	Biolegend	576402	Available from multiple suppliers, test activity before experiments
Recombinant mouse RANKL	Shenandoah Biotechnology	200-04	Available from multiple suppliers, test activity before experiments
Recombinant human Jagged1-Fc	R&D Systems	1277-JG-050	Available from multiple suppliers, test activity before experiments
Protein G agarose beads	InvivoGen	gel-agg-2
Goat anti-human IgG Fc	Jackson ImmunoResearch	109-001-008
Minimum Essential Medium powder	Sigma-Aldrich	M0894
Accutase cell dissociation reagent	ThermoFisher	A1110501	Used to lift osteoclast precursors
Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit	Sigma-Aldrich	387A-1KT	Used to stain differentiated osteoclasts