التصور الكمي من التسلل الكريات البيض في نموذج الفئران من التهاب عضلة القلب مداهم من قبل ورقة ضوء المجهري
Summary
هنا، ونحن تصف نهج ورقة المجهر الضوئي لتصور القلب CD45 + الكريات البيض التسلل في نموذج الفئران من التهاب عضلة القلب مداهم العقيم، والذي يسببه العلاج داخل الخناق السموم علاج الفئران CD11c.DTR.
Abstract
أصبح ضوء ورقة المجهري مضان (لسفم)، جنبا إلى جنب مع بروتوكولات المقاصة الكيميائية، المعيار الذهبي لتحليل الهياكل فلورزنتلي المسمى في العينات البيولوجية الكبيرة، وينخفض إلى دقة الخلوية. وفي الوقت نفسه، فإن التحسين المستمر للبروتوكولات الأساسية وتعزيز توافر النظم التجارية المتخصصة تمكننا من التحقيق في المجهرية لأجهزة الفأر كله وحتى تسمح لتوصيف السلوك الخلوي في مختلف نهج التصوير الخلية الحية. هنا، نحن تصف بروتوكول للتصور المكاني كله جبل والتقدير الكمي للسكان CD45 + الكريات البيض في قلوب الفأر الملتهبة. طريقة توظف سلالة الماوس المعدلة وراثيا (CD11c.DTR) التي أظهرت مؤخرا لتكون بمثابة نموذج قوي، محرض لدراسة تطور التهاب عضلة القلب المميتة مداهم، تتميز عدم انتظام ضربات القلب القاتلة. ويشمل هذا البروتوكول تحريض عضلة القلب الحث، إنترافيتتلطيخ خلية بوساطة الأجسام المضادة، وإعداد الجهاز، و لسفم مع صورة بمساعدة الحاسوب بعد المعالجة. على الرغم من تقديمها على أنها وسيلة تكييفها للغاية لسؤالنا العلمي معين، بروتوكول يمثل مخططا لنظام قابل للتعديل بسهولة التي يمكن أيضا استهداف هياكل الفلورسنت مختلفة تماما في الأجهزة الأخرى وحتى في الأنواع الأخرى.
Introduction
خلال تطور المجهر الضوئي، ظهرت العديد من الأشكال المتخصصة، وكلها وضعت للحد من القيود في عملية التصور لعينات معينة. واحدة من هذه الطريقة هي ورقة ضوء المجهر مضان (لسفم). وضعت لأول مرة في عام 1903 من قبل سيدنتوف وزيغموندي 1 وإيجاد أول التطبيقات البيولوجية الأساسية في 1990s في وقت مبكر 2 ، أصبح لسفم أداة المجهرية أقوى حتى الآن لتصور العينات الكبيرة، مثل أجهزة الماوس سليمة، مع إشارة إشارة الفلورسنس وصولا الى المستوى الخلوي. وبسبب هذه الفوائد، جنبا إلى جنب مع إمكاناتها لتصوير الخلايا الحية، واسم طرق الطبيعة لسفم "أسلوب السنة 2014 3 ".
وكما يوحي اسمها، يتم إجراء إضاءة العينة في لسفم من قبل ورقة الضوء، والتي يتم توجيهها عموديا على محور الهدف المستخدم fأو جمع الضوء الانبعاثات وتشكيل الصورة اللاحقة. وعادة ما يتم إنشاء ورقة الضوء إما عن طريق التركيز واسعة، شعاع الليزر الموازاة مع عدسة أسطوانية أو عن طريق حركة جانبية سريعة من الحزم الليزر الضيقة، وتركز في واحد فقط الأفقي أو الرأسي الطائرة 4 ، 5 . وبهذه الطريقة، يتم إضاءة فقط المستوى البؤري للبصريات التصوير، وعادة مع سمك 1-4 ميكرون. وبالتالي، لعينة الفلورسنت وضعت في الطائرة الإضاءة، كل من جيل من الضوء المتناثرة وآثار فوتوبلاشينغ من المناطق فوق أو تحت الطائرة البؤرية يتم القضاء عليها أو قمعها إلى حد كبير 6 ، 7 . وبما أن جميع الطائرات خارج البؤرة ليست مضيئة، يتم حذف تأثيرات فوتوبلاشينغ في هذه المناطق. على النقيض من متحد البؤر القياسية أو متعددة الفوتون المجهري، ومسارات ضوء مضيئة والمنبعثة منفصلة عن بعضها البعض، وبالتالي فإن الصورة النهائية كوال إيتي لا تعتمد على التركيز المثالي من شعاع ضوء الإثارة من خلال الأهداف. اعتمادا على السؤال الأساسي، وبالتالي فمن الممكن استخدام الأهداف مع مجال هائل من الرأي (فوف) بحيث أكبر منطقة ممكنة من الطائرة مضيئة يمكن تصويرها دون أي أجزاء مكون تتحرك في اتجاه زي.
في أنظمة لسفم الحديثة، يتم التقاط صورة الفلورسنت من القسم البصري ولدت على جهاز حساسة للغاية تهمة اقتران (كسد) أو مكملة أشباه الموصلات أكسيد المعادن (كموس) الكاميرات، التي هي قادرة على الحصول على كامل مجال الرؤية (فوف) في ميكروثانية. لذلك، عن طريق تحريك العينة من خلال ورقة الضوء والحصول على الصور في خطوات Z محددة، فمن الممكن الحصول على معلومات 3D كاملة من عينة في فترة معقولة من الزمن 8 ، 9 ، مما يجعل هذه التقنية تنطبق على الخلية الحية الدراسات 10 ،أس = "كريف"> 11 ، 12 .
ومع ذلك، على الرغم من لسفم يوفر طريقة سريعة وحساسة، ومضان مضان، انتقال الضوء من خلال العينة لا تزال قضية رئيسية، وخصوصا عندما تكون العينات البيولوجية الكبيرة هي الهدف لتحليل 3D. يتم تعديل انتقال الضوء بشكل حاسم من قبل الجوانب الفيزيائية للامتصاص وبانتثار الضوء في واجهات الهياكل مع مؤشرات الانكسار مختلفة 13 . لذلك، عندما عينات التصوير عدة مليمترات في الحجم، يتم الجمع بين لسفم في الغالب مع بروتوكولات المقاصة لجعل العينات شفافة بصريا. وتستند هذه التقنيات على فكرة إزالة المياه من الأنسجة البيولوجية ذات الصلة وتبادلها مع وسائل الإعلام الغمر المائي أو العضوي القائم على المذيبات، والتي يتم اختيارها لتتناسب بشكل ضيق مع مؤشرات الانكسار من مكونات الأنسجة المستهدفة معينة. ونتيجة لذلك، يتم تقليل تشتت الضوء الجانبي، وجميع الأطوال الموجيةمن الضوء يمكن أن تمر أكثر كفاءة من خلال الأنسجة 13 . في كثير من الحالات، تظهر العينات البيولوجية التي تعامل بهذه الطريقة ظاهريا واضحة وضوح الشمس، والتي تمكن لسفم أن تجري، حتى على أجهزة الماوس بأكملها، وذلك باستخدام لمسافات طويلة العمل، وأهداف التكبير منخفضة.
هنا، نقدم بروتوكول التحضير للتصوير عينة كبيرة في المجهر ورقة الضوء (انظر الجدول من المواد)، التي أنشأناها للتحقيق في التسلل القلبي الخلوي في نموذج الفئران من التهاب عضلة القلب 15 . CD11c.DTR الفئران تعبر عن مستقبلات السموم الخناق الرئيسيات (دتر) تحت سيطرة CD11c المروج 16 . ونتيجة لذلك، يتم عرض الخلايا في هذه الفئران، والتي تعبر عن CD11c جنبا إلى جنب مع دتر، حساسة للذيفان الداخلي للالدفتيريا الخناق (الدفتيريا السم، دتكس). والعلاج المنهجي لهذه الحيوانات مع دتكس النتائج في استنفاد جميع CD11c + سيLLS. CD11c هو إنتغرين و، كمستقبلات سطح الخلية لمجموعة متنوعة من العوامل القابلة للذوبان المختلفة، وتشارك في عمليات التنشيط والنضج أساسا في خلايا النسب مونوسيتيك 17 . ونتيجة لذلك، وقد تم استخدام نموذج الماوس CD11c.DTR بشكل مكثف لدراسة دور الخلايا الجذعية والمجموعات الفرعية بلعم في سياق العديد من الأسئلة المناعية المختلفة. مع مرور الوقت، فقد أفيد أن الفئران CD11c.DTR تعامل بشكل منهجي مع دتكس يمكن أن تتطور الآثار الجانبية السلبية ويمكن عرض معدلات وفيات مرتفعة بقوة 18 ، 19 . في الآونة الأخيرة، كنا قادرين على تحديد السبب الكامن وراء الوفاة 15 ، واصفا تطور التهاب عضلة القلب مداهم بعد تطبيق دتكس داخل القصبة الهوائية في هذه الحيوانات. تسبب تحدي السموم الدمار الخلوي، بما في ذلك في الأجزاء الوسطى من نظام نقل التحفيز في القلب. ورافق ذلك CD45 ضخمة+ الكريات البيض التسلل، مما يؤدي في النهاية إلى عدم انتظام ضربات القلب القاتلة. في هذه الحالة، لم يكن فقط ظهور السكان الكريات البيض مهمة، ولكن أيضا التوزيع المكاني داخل القلب. هذا السؤال التجريبي هو التحدي للتصوير المجهري الحديث، والتي قمنا حلها من خلال نهج ورقة المجهر الضوئي الذي يدعمه تلطيخ الأجسام المضادة إنترافيتال والبروتوكول القائم على المذيبات العضوية القائمة على المقاصة البصرية.
Protocol
Representative Results
Discussion
في علوم الحياة الحديثة، والتصور المجهري للعمليات البيولوجية يلعب دورا متزايد الأهمية. في هذا السياق، تم تحقيق العديد من التطورات خلال القرنين الماضيين التي تساعد على الإجابة على الأسئلة التي لا يمكن معالجتها حتى هذه النقطة،. أولا، كان هناك ميل واضح إلى زيادة جذرية ?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيدت البحوث في مختبر غونزر من قبل وزارة التعليم والبحث الاتحادية الألمانية (منحة رقم 0315590 م) ومؤسسة الأبحاث الألمانية (منحة رقم GU769 / 4-1، GU769 / 4-2). كما نشكر إمسيس على الدعم الفني وسيباستيان كوبات للمساعدة في 3D النمذجة الكرتون.
Materials
| diphtheria toxin | Sigma Aldrich | D0564 | |
| phosphate buffered saline | Biochrom | L182-10 | |
| ketamine [50 mg/ml] | Inresa | PZN 4089014 | |
| xylazine [2 %] | Ceva | ||
| syringe | Braun | REF 9161502 | Braun Omincan F |
| indwelt venous catheter | Becton Dickinson | REF 381923 | BD Insyte Autoguard |
| small animal respirator | Harvard Apparatus | 73-0044 | MiniVent |
| anit-CD45 antibody (AF647) | BioLegend | 103124 | |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) disodium salt dihydrate | Carl Roth | 8043.2 | |
| catheter (21 G) | BD Biosciences | REF 387455 | BD valu-set |
| paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| PE tube (5 ml) | Carl Roth | EKY9.1 | Rotilabo |
| ethanol | Carl Roth | 9065.4 | |
| dibenzyl ether | Sigma-Aldrich | 108014 | |
| tube rotator | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | MACSmix |
| agarose (low gelling) | Sigma Aldrich | A4018 | |
| mold (15x15x5 mm) | Tissue Tek | 4566 | Cryomold |
| light sheet microscope system | LaVision Biotec | Ultramicroscope | |
| microscope body | Olympus | MVX10 | |
| objective | Olympus | 0.5 NA MVPLAPO 2XC, WD 5.5 mm | |
| sCMOS camera 5.5MP | Andor Technology | ||
| 488 nm OPSL (50mW) laser | Coherent | ||
| 647 nm diode laser (50mW) | Coherent | ||
| 3D image processing & analysis software | Bitplane | IMARIS Ver. 8.3 | |
| transgenic mouse strain | Steffen Jung et al. | CD11c.DTR | |
| wt mouse strain | Envigo | Balb/c Ola Hsd J | |
| Laser Module | LaVision Biotec | ||
| MVPLAPO 2XC Objective Lens |
Referenzen
- Siedentopf, H., Uber Zsigmondy, R. Sichtbarmachung und Größenbestimmung ultramikoskopischer Teilchen, mit besonderer Anwendung auf Goldrubingläser. Annalen der Physik. 315 (1), 1-39 (1902).
- Voie, A. H., Burns, D. H., Spelman, F. A. Orthogonal-plane fluorescence optical sectioning: three-dimensional imaging of macroscopic biological specimens. J. Microsc. 170 (Pt 3), 229-236 (1993).
- Epp, J. R., et al. Optimization of CLARITY for Clearing Whole-Brain and Other Intact Organs(1,2,3). eNeuro. 2 (3), (2015).
- Greger, K., Swoger, J., Stelzer, E. H. Basic building units and properties of a fluorescence single plane illumination microscope. Rev. Sci. Instrum. 78 (2), 023705 (2007).
- Keller, P. J., Stelzer, E. H. Digital scanned laser light sheet fluorescence microscopy. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (5), (2010).
- Becker, K., Jahrling, N., Kramer, E. R., Schnorrer, F., Dodt, H. U. Ultramicroscopy: 3D reconstruction of large microscopical specimens. J Biophotonics. 1 (1), 36-42 (2008).
- Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nat. Methods. 4 (4), 331-336 (2007).
- Taormina, M. J., et al. Investigating bacterial-animal symbioses with light sheet microscopy. Biol. Bull. 223 (1), 7-20 (2012).
- Klingberg, A., et al. Fully Automated Evaluation of Total Glomerular Number and Capillary Tuft Size in Nephritic Kidneys Using Lightsheet Microscopy. J. Am. Soc. Nephrol. , (2016).
- Truong, T. V., Supatto, W., Koos, D. S., Choi, J. M., Fraser, S. E. Deep and fast live imaging with two-photon scanned light-sheet microscopy. Nat. Methods. 8 (9), 757-760 (2011).
- Schmid, B., et al. High-speed panoramic light-sheet microscopy reveals global endodermal cell dynamics. Nat Commun. 4, 2207 (2013).
- Cella Zanacchi, F., et al. Live-cell 3D super-resolution imaging in thick biological samples. Nat. Methods. 8 (12), 1047-1049 (2011).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Maruyama, A., et al. Wide field intravital imaging by two-photon-excitation digital-scanned light-sheet microscopy (2p-DSLM) with a high-pulse energy laser. Biomed Opt Express. 5 (10), 3311-3325 (2014).
- Mann, L., et al. CD11c.DTR mice develop a fatal fulminant myocarditis after local or systemic treatment with diphtheria toxin. Eur. J. Immunol. 46 (8), 2028-2042 (2016).
- Jung, S., et al. In vivo depletion of CD11c+ dendritic cells abrogates priming of CD8+ T cells by exogenous cell-associated antigens. Immunity. 17 (2), 211-220 (2002).
- Corbi, A. L., Lopez-Rodriguez, C. CD11c integrin gene promoter activity during myeloid differentiation. Leuk. Lymphoma. 25 (5-6), 415-425 (1997).
- Zaft, T., Sapoznikov, A., Krauthgamer, R., Littman, D. R., Jung, S. CD11chigh dendritic cell ablation impairs lymphopenia-driven proliferation of naive and memory CD8+ T cells. J. Immunol. 175 (10), 6428-6435 (2005).
- Zammit, D. J., Cauley, L. S., Pham, Q. M., Lefrancois, L. Dendritic cells maximize the memory CD8 T cell response to infection. Immunity. 22 (5), 561-570 (2005).
- Hasenberg, M., Kohler, A., Bonifatius, S., Jeron, A., Gunzer, M. Direct observation of phagocytosis and NET-formation by neutrophils in infected lungs using 2-photon microscopy. J. Vis. Exp. (52), (2011).
- Bailey, B., Farkas, D. L., Taylor, D. L., Lanni, F. Enhancement of axial resolution in fluorescence microscopy by standing-wave excitation. Nature. 366 (6450), 44-48 (1993).
- Gustafsson, M. G. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. J. Microsc. 198 (Pt 2), 82-87 (2000).
- Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Opt Lett. 19 (11), 780-782 (1994).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys. J. 91 (11), 4258-4272 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat. Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
- Abbe, E. Beiträge zur Theorie des Mikroskops und der mikroskopischen Wahrnehmung. Archiv für mikroskopische Anatomie. 9 (1), 413-418 (1873).
- Göppert-Mayer, M. Über Elementarakte mit zwei Quantensprüngen. Annalen der Physik. 401 (3), 273-294 (1931).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Männ, L., et al. CD11c.DTR mice develop a fatal fulminant myocarditis after local or systemic treatment with diphtheria toxin. Eur. J. Immunol. , (2016).
- Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat. Neurosci. 16 (8), 1154-1161 (2013).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nat. Protoc. 7 (11), 1983-1995 (2012).
- Dirckx, J. J., Kuypers, L. C., Decraemer, W. F. Refractive index of tissue measured with confocal microscopy. J Biomed Opt. 10 (4), 44014 (2005).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nat. Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).
- Schwarz, M. K., et al. Fluorescent-protein stabilization and high-resolution imaging of cleared, intact mouse brains. PLoS One. 10 (5), e0124650 (2015).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat. Neurosci. 14 (11), 1481-1488 (2011).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
- Shivapathasundharam, B., Berti, A. E. Transparent tooth model system. An aid in the study of root canal anatomy. Indian J. Dent. Res. 11 (3), 89-94 (2000).
- Karreman, M. A., et al. Fast and precise targeting of single tumor cells in vivo by multimodal correlative microscopy. J. Cell Sci. 129 (2), 444-456 (2016).
- Pan, C., et al. Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO. Nat. Methods. 13 (10), 859-867 (2016).
