Количественная визуализация инфильтрата лейкоцитов в мышиной модели фульминантного миокардита методом микроскопии легких листов
Summary
Здесь мы опишем метод микроскопии легких листов для визуализации инфильтрата сердечного CD45 + лейкоцита в мышиной модели асептического молниеносного миокардита, который индуцируется внутритрахеальной терапией дифтерийным токсином мышей CD11c.DTR.
Abstract
Световая флуоресцентная микроскопия (LSFM) в сочетании с протоколами химического очищения стала золотым стандартом для анализа флуоресцентно меченых структур в крупных биологических образцах и доходит до клеточного разрешения. Между тем, постоянное совершенствование базовых протоколов и расширение доступности специализированных коммерческих систем позволяют нам исследовать микроструктуру целых органов мыши и даже учитывать характеристики поведения клеток в различных подходах к визуализации живых клеток. Здесь мы описываем протокол для пространственной визуализации целостного монтирования и количественной оценки популяции лейкоцитов CD45 + в воспаленных сердцах мыши. В этом методе используется трансгенный штамм мыши (CD11c.DTR), который недавно был показан как надежная, индуцибельная модель для изучения развития молниеносного фатального миокардита, характеризующегося летальными сердечными аритмиями. Этот протокол включает индукцию миокардита, интравитОпосредованное антителом антитело, окрашивание клеток, подготовка органов и LSFM с последующей последующей обработкой изображения с помощью компьютера. Несмотря на то, что он представлен как высоко адаптированный метод для нашего конкретного научного вопроса, протокол представляет собой схему легко регулируемой системы, которая может также нацеливаться на совершенно разные флуоресцентные структуры в других органах и даже на других видах.
Introduction
Во время эволюции световой микроскопии появилось много специализированных форм, все они были разработаны для минимизации ограничений в процессе визуализации для отдельных образцов. Одним из таких методов является световая флуоресцентная микроскопия (LSFM). Впервые разработанный в 1903 году Siedentopf и Zsigmondy 1 и находя свой первый фундаментальный биологический прием в начале 1990-х годов 2 , LSFM стал самым мощным микроскопическим инструментом на сегодняшний день для визуализации крупных образцов, таких как интактные органы мыши, с разрешением сигнала флуоресценции Вплоть до уровня сотовой связи. Из-за этих преимуществ, в сочетании со своим потенциалом для визуализации живых клеток, Методы Природы назвали LSFM «Метод года 2014 3» .
Как следует из названия, подсветка образца в LSFM проводится световыми листами, которые ориентированы перпендикулярно оси используемой цели fИли сбор светового излучения и последующее формирование изображения. Легкий лист обычно генерируется либо путем фокусировки широких, коллимированных лазерных лучей с цилиндрической линзой, либо путем быстрого бокового движения узких фокусированных лазерных лучей только в одной горизонтальной или вертикальной плоскости 4 , 5 . Таким образом, освещается только фокальная плоскость оптики изображения, обычно с толщиной 1-4 мкм. Следовательно, для флуоресцентного образца, помещенного в плоскость освещения, как генерация рассеянного света, так и эффекты фотообесцвечивания из областей выше или ниже фокальной плоскости устраняются или сильно подавляются 6 , 7 . Поскольку все плоскости вне фокуса не подсвечиваются, в этих областях отсутствуют эффекты фотообесцвечивания. В отличие от стандартной конфокальной или многофотонной микроскопии пути освещенного и излучаемого света отделены друг от друга, поэтому качество конечного изображения Не зависит от идеальной фокусировки пучка возбуждающего света через цели. Поэтому в зависимости от основного вопроса можно использовать цели с огромным полем обзора (FOV), чтобы можно было визуализировать максимально возможную площадь освещенной плоскости без каких-либо составных частей, движущихся в направлении xy.
В современных LSFM-системах флуоресцентное изображение генерируемого оптического участка захватывается на высокочувствительном устройстве с зарядовой связью (CCD) или дополнительными металлооксидными полупроводниковыми (CMOS) камерами, которые могут приобретать все поле зрения (FOV) В микросекундах. Поэтому, перемещая образец через световой лист и приобретая изображения с заданными z-ступенями, можно получить полную трехмерную информацию образца за разумное время 8 , 9 , что делает эту методику применимой к живым клеткам Исследования 10 ,Ass = "xref"> 11 , 12 .
Тем не менее, хотя LSFM предлагает быстрый, чувствительный и удобный для флуоресценции метод, передача света через образец по-прежнему является серьезной проблемой, особенно когда большие биологические образцы являются объектом 3D-анализа. Передача света критически модифицируется физическими аспектами поглощения и рассеяния света на границах структур с различными показателями преломления 13 . Поэтому, когда изображения обрабатывают несколько миллиметров в размерах, LSFM в основном объединяется с протоколами очистки, чтобы сделать выборки оптически прозрачными. Эти методы основаны на идее удаления воды из соответствующей биологической ткани и обмена ее с водными или (органическими) растворителями на основе растворителя, которые выбираются так, чтобы они были в узком соответствии с показателями преломления конкретных компонентов ткани-мишени. В результате боковое рассеяние света минимизируется, и все длины волнСвета может намного более эффективно проходить через ткань 13 . Во многих случаях биологические образцы, обработанные таким образом, кажутся макроскопически кристально чистыми, что позволяет проводить LSFM даже на всех органах мыши с использованием длинных рабочих расстояний с небольшим увеличением.
Здесь мы представляем протокол подготовки изображений с большой выборкой в световом микроскопе (см. Таблицу материалов), который мы установили для исследования клеточного сердечного инфильтрата в мышиной модели миокардита 15 . Мыши CD11c.DTR экспрессируют рецептор дифтерийного токсина приматов (DTR) под контролем промотора 16 CD11c. Следовательно, клетки у этих мышей, которые экспрессируют CD11c вместе с DTR, чувствительны к экзотоксину Corynebacterium diphtheria (дифтерийный токсин, DTX); Системное лечение этих животных с помощью DTX приводит к истощению всего CD11c + ceLLS. CD11c является интегрином и в качестве рецептора клеточной поверхности для множества различных растворимых факторов участвует в процессах активации и созревания в основном в клетках моноцитарной линии 17 . Следовательно, модель мыши CD11c.DTR интенсивно использовалась для изучения роли дендритных клеток и подмножеств макрофагов в контексте многих различных иммунологических вопросов. Со временем сообщалось, что мыши CD11c.DTR, системно обработанные DTX, могут вызывать неблагоприятные побочные эффекты и могут демонстрировать значительно повышенную смертность 18 , 19 . Недавно мы смогли идентифицировать основную причину смерти 15 , описывая развитие молниеносного миокардита после применения внутритрахеального DTX у этих животных. Проблема токсина вызывала разрушение клеток, в том числе в центральных частях системы передачи стимулов в сердце. Это сопровождалось массивным CD45+ Инфильтрат лейкоцитов, что в конечном итоге приводит к летальным сердечным аритмиям. В этом случае важно не только появление популяции лейкоцитов, но и его пространственное распределение внутри сердца. Этот экспериментальный вопрос представляет собой проблему для современной микроскопической визуализации, которую мы решили методом светового микроскопа, который поддерживается окрашиванием подмышечных антител и протоколом оптического очищения на основе органического растворителя.
Protocol
Representative Results
Discussion
В современной науке о жизни микроскопическая визуализация биологических процессов играет все более важную роль. В этом контексте за последние два столетия было достигнуто много событий, которые помогают отвечать на вопросы, не адресуемые до этого момента. Во-первых, существует явная ?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Исследования в лаборатории Gunzer были поддержаны Федеральным министерством образования и исследований Германии (грант № 0315590 AD) и Немецким исследовательским фондом (грант № GU769 / 4-1, GU769 / 4-2). Мы также благодарим IMCES за техническую поддержку и Себастьяна Кубата за помощь в 3D-моделировании мультфильмов.
Materials
| diphtheria toxin | Sigma Aldrich | D0564 | |
| phosphate buffered saline | Biochrom | L182-10 | |
| ketamine [50 mg/ml] | Inresa | PZN 4089014 | |
| xylazine [2 %] | Ceva | ||
| syringe | Braun | REF 9161502 | Braun Omincan F |
| indwelt venous catheter | Becton Dickinson | REF 381923 | BD Insyte Autoguard |
| small animal respirator | Harvard Apparatus | 73-0044 | MiniVent |
| anit-CD45 antibody (AF647) | BioLegend | 103124 | |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) disodium salt dihydrate | Carl Roth | 8043.2 | |
| catheter (21 G) | BD Biosciences | REF 387455 | BD valu-set |
| paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| PE tube (5 ml) | Carl Roth | EKY9.1 | Rotilabo |
| ethanol | Carl Roth | 9065.4 | |
| dibenzyl ether | Sigma-Aldrich | 108014 | |
| tube rotator | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | MACSmix |
| agarose (low gelling) | Sigma Aldrich | A4018 | |
| mold (15x15x5 mm) | Tissue Tek | 4566 | Cryomold |
| light sheet microscope system | LaVision Biotec | Ultramicroscope | |
| microscope body | Olympus | MVX10 | |
| objective | Olympus | 0.5 NA MVPLAPO 2XC, WD 5.5 mm | |
| sCMOS camera 5.5MP | Andor Technology | ||
| 488 nm OPSL (50mW) laser | Coherent | ||
| 647 nm diode laser (50mW) | Coherent | ||
| 3D image processing & analysis software | Bitplane | IMARIS Ver. 8.3 | |
| transgenic mouse strain | Steffen Jung et al. | CD11c.DTR | |
| wt mouse strain | Envigo | Balb/c Ola Hsd J | |
| Laser Module | LaVision Biotec | ||
| MVPLAPO 2XC Objective Lens |
Referenzen
- Siedentopf, H., Uber Zsigmondy, R. Sichtbarmachung und Größenbestimmung ultramikoskopischer Teilchen, mit besonderer Anwendung auf Goldrubingläser. Annalen der Physik. 315 (1), 1-39 (1902).
- Voie, A. H., Burns, D. H., Spelman, F. A. Orthogonal-plane fluorescence optical sectioning: three-dimensional imaging of macroscopic biological specimens. J. Microsc. 170 (Pt 3), 229-236 (1993).
- Epp, J. R., et al. Optimization of CLARITY for Clearing Whole-Brain and Other Intact Organs(1,2,3). eNeuro. 2 (3), (2015).
- Greger, K., Swoger, J., Stelzer, E. H. Basic building units and properties of a fluorescence single plane illumination microscope. Rev. Sci. Instrum. 78 (2), 023705 (2007).
- Keller, P. J., Stelzer, E. H. Digital scanned laser light sheet fluorescence microscopy. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (5), (2010).
- Becker, K., Jahrling, N., Kramer, E. R., Schnorrer, F., Dodt, H. U. Ultramicroscopy: 3D reconstruction of large microscopical specimens. J Biophotonics. 1 (1), 36-42 (2008).
- Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nat. Methods. 4 (4), 331-336 (2007).
- Taormina, M. J., et al. Investigating bacterial-animal symbioses with light sheet microscopy. Biol. Bull. 223 (1), 7-20 (2012).
- Klingberg, A., et al. Fully Automated Evaluation of Total Glomerular Number and Capillary Tuft Size in Nephritic Kidneys Using Lightsheet Microscopy. J. Am. Soc. Nephrol. , (2016).
- Truong, T. V., Supatto, W., Koos, D. S., Choi, J. M., Fraser, S. E. Deep and fast live imaging with two-photon scanned light-sheet microscopy. Nat. Methods. 8 (9), 757-760 (2011).
- Schmid, B., et al. High-speed panoramic light-sheet microscopy reveals global endodermal cell dynamics. Nat Commun. 4, 2207 (2013).
- Cella Zanacchi, F., et al. Live-cell 3D super-resolution imaging in thick biological samples. Nat. Methods. 8 (12), 1047-1049 (2011).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Maruyama, A., et al. Wide field intravital imaging by two-photon-excitation digital-scanned light-sheet microscopy (2p-DSLM) with a high-pulse energy laser. Biomed Opt Express. 5 (10), 3311-3325 (2014).
- Mann, L., et al. CD11c.DTR mice develop a fatal fulminant myocarditis after local or systemic treatment with diphtheria toxin. Eur. J. Immunol. 46 (8), 2028-2042 (2016).
- Jung, S., et al. In vivo depletion of CD11c+ dendritic cells abrogates priming of CD8+ T cells by exogenous cell-associated antigens. Immunity. 17 (2), 211-220 (2002).
- Corbi, A. L., Lopez-Rodriguez, C. CD11c integrin gene promoter activity during myeloid differentiation. Leuk. Lymphoma. 25 (5-6), 415-425 (1997).
- Zaft, T., Sapoznikov, A., Krauthgamer, R., Littman, D. R., Jung, S. CD11chigh dendritic cell ablation impairs lymphopenia-driven proliferation of naive and memory CD8+ T cells. J. Immunol. 175 (10), 6428-6435 (2005).
- Zammit, D. J., Cauley, L. S., Pham, Q. M., Lefrancois, L. Dendritic cells maximize the memory CD8 T cell response to infection. Immunity. 22 (5), 561-570 (2005).
- Hasenberg, M., Kohler, A., Bonifatius, S., Jeron, A., Gunzer, M. Direct observation of phagocytosis and NET-formation by neutrophils in infected lungs using 2-photon microscopy. J. Vis. Exp. (52), (2011).
- Bailey, B., Farkas, D. L., Taylor, D. L., Lanni, F. Enhancement of axial resolution in fluorescence microscopy by standing-wave excitation. Nature. 366 (6450), 44-48 (1993).
- Gustafsson, M. G. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. J. Microsc. 198 (Pt 2), 82-87 (2000).
- Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Opt Lett. 19 (11), 780-782 (1994).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys. J. 91 (11), 4258-4272 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat. Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
- Abbe, E. Beiträge zur Theorie des Mikroskops und der mikroskopischen Wahrnehmung. Archiv für mikroskopische Anatomie. 9 (1), 413-418 (1873).
- Göppert-Mayer, M. Über Elementarakte mit zwei Quantensprüngen. Annalen der Physik. 401 (3), 273-294 (1931).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Männ, L., et al. CD11c.DTR mice develop a fatal fulminant myocarditis after local or systemic treatment with diphtheria toxin. Eur. J. Immunol. , (2016).
- Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat. Neurosci. 16 (8), 1154-1161 (2013).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nat. Protoc. 7 (11), 1983-1995 (2012).
- Dirckx, J. J., Kuypers, L. C., Decraemer, W. F. Refractive index of tissue measured with confocal microscopy. J Biomed Opt. 10 (4), 44014 (2005).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nat. Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).
- Schwarz, M. K., et al. Fluorescent-protein stabilization and high-resolution imaging of cleared, intact mouse brains. PLoS One. 10 (5), e0124650 (2015).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat. Neurosci. 14 (11), 1481-1488 (2011).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
- Shivapathasundharam, B., Berti, A. E. Transparent tooth model system. An aid in the study of root canal anatomy. Indian J. Dent. Res. 11 (3), 89-94 (2000).
- Karreman, M. A., et al. Fast and precise targeting of single tumor cells in vivo by multimodal correlative microscopy. J. Cell Sci. 129 (2), 444-456 (2016).
- Pan, C., et al. Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO. Nat. Methods. 13 (10), 859-867 (2016).
