Detektion von Liganden-aktivierte G-Protein gekoppelten Rezeptor-Internalisierung durch konfokale Mikroskopie
Summary
Dieses Protokoll beschreibt Konfokalmikroskopie Nachweis von G-Protein-gekoppelten Rezeptor (GPCR) Internalisierung in Säugerzellen. Es umfasst die Grundzellkultur, Transfektion und Konfokalmikroskopie Verfahren und stellt ein effizientes und leicht interpretierbares Verfahren, die subzelluläre Lokalisierung und Internalisierung von Fusion exprimierten GPCR zu detektieren.
Abstract
Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is an optical imaging technique for high-contrast imaging. It is a powerful approach to visualize fluorescent fusion proteins, such as green fluorescent protein (GFP), to determine their expression, localization, and function. The subcellular localization of target proteins is important for identification, characterization, and functional analyses. Internalization is one of the predominant mechanisms controlling G protein-coupled receptor (GPCR) signaling to ensure the appropriate cellular responses to stimuli. Here, we describe an experimental method to detect the subcellular localization and internalization of GPCR in HEK293 cells with confocal microscopy. In addition, this experiment provides some details about cell culture and transfection. This protocol is compatible with a variety of widely available fluorescent markers and is applicable to the visualization of the subcellular localization of a majority of proteins, as well as of the internalization of GPCR. This technique should enable researchers to efficiently manipulate GPCR gene expression in mammalian cell lines and should facilitate studies on GPCR subcellular localization and internalization.
Introduction
Zellen Frachthandel Maschinen besitzen extrazelluläre Materialien-wie Liganden, Mikroorganismen, Nährstoffe zu transportieren und Transmembranproteine-in die Zelle für Information, Energie und andere Zwecke 1, 2. Es ist von entscheidender Bedeutung für die zelluläre Homöostase, Gewebefunktion, und die allgemeine Überleben der Zelle. Die zellbasierte Expression von fluoreszierenden Fusionsproteinen ist eine leistungsfähige Methode die Lokalisierung und Internalisierung von Transmembran – Rezeptoren, wie G – Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCR) zu untersuchen, in Signalweg 3.
Die Expression von Fusionsproteinen mit grün fluoreszierendem Protein (GFP) markiert aus Qualle Aequorea victoria, direkte Fluoreszenznachweistechniken kombiniert werden , hat breite Akzeptanz in Protein-Targeting Research 4, 5, 6 gewonnen. GFP-basierte DETECTIauf den Vorteil der Echtzeit – Abbildung von lebenden Zellen ermöglicht , während Fixations Artefakte vermieden 7. Eine Reihe von vielseitigen Klonierungsvektoren wurde in verschiedenen Zellen 8, 9 , die Expression von Proteinfusionen auf GFP zu erleichtern konstruiert. Der pEGFP-N1-Vektor ist ein weit verbreiteter und kommerzialisierte Plasmidvektor ein verbessertes grün fluoreszierendes Protein (EGFP) kodieren, die für hellere Fluoreszenz und höhere Expression in Säugerzellen von Wildtyp-GFP optimiert wurde. Um das Fluoreszenzsignal von EGFP zu beobachten in Säugerzellen exprimiert, sollte die Fluoreszenzmikroskopie mit einer Anregung bei 488 nm und der Emission bei 507 nm, vorzugsweise mit konfokaler Mikroskopie durchgeführt werden.
Überwachung der subzellulären Lokalisation und Ligand-vermittelte Internalisierung der Rezeptoren ist eine übliche Technik , die die Signaltransduktion und Funktion von GPCRs 10 zu untersuchen , </sbis> 11. In den meisten Fällen führt zu Internalisierung Desensibilisierung der GPCRs (die Dämpfung der Reizantwort , trotz der Anwesenheit von Agonisten) 12, 13. Die internalisierten Rezeptoren können in die Lysosomen aufgenommen werden und abgebaut werden, oder sie können wieder an die Zelloberfläche zurückgeführt werden, abhängig von der Art der Rezeptoren und die in den Experimenten verwendeten Zelllinien.
Die Gonadotropin-Releasing – Hormon – Rezeptoren (GnRHRs) gehören zu der GPCR – Familie und haben eine typische GPCR – Proteinstruktur, mit einer extrazellulären aminoterminalen, ein intrazelluläres -COOH – Terminal, und sieben Transmembran (TM) -Domäne 14. Die Transfektion des rekombinanten Plasmids Sj GnRHR-EGFP (mit den GnRHR – Genen aus Sepiella japonica) und der konfokalen Mikroskopie Nachweis von EGFP-markierten Sj GnRHR (in HEK293 – Zellen exprimiert) wurden berichtet früsly und GFP – Fluoreszenz wurde 15 als Reporter für Transmembranprotein Lokalisierungs Assays etabliert. Nun wird die Internalisierung von Sj GnRHR, aktiviert durch S. japonica Gonadotropin-Releasing – Hormon (GnRH Sj) wurde in zeit- und dosisabhängigen Art und Weise durch konfokale Mikroskopie demonstriert.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das Protokoll hier vorgestellten bietet eine effiziente und einfach zu interpretierende Methode, um die subzelluläre Lokalisierung und Internalisierung von exprimierten GPCR-Fusionsprotein in HEK293-Zellen zu erkennen. Die Technik kann leicht für viele verschiedene Gene und Zelltypen angepasst werden, wie für die zelluläre Lokalisation und Internalisierung des Rezeptors corazonin von Bombyx mori in HEK293 und BmN Zellen 16.
Die erfolgreiche Anwendung dies…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors of this paper would like to thank Prof. Jiayan Xie for technical assistance and equipment usage. This work was financially supported by the National Natural Science Foundation of China (41406137).
Materials
| HEK293 cell line | |||
| DMEM/High glucose | Hyclone | SH30022.01 | High glucose 4.0 mM L-glutamine |
| Foetal Bovine Serum (FBS) | PuFei | 1101-100 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Genom | GNM10010 | |
| Penicillin-Streptomycin | Genom | GNM15140 | |
| 0.25% Trypsin & 0.02% EDTA | Genom | GNM25200 | |
| Opti-MEM (1X) | GIBCO, by Life Technologies | 31985-062 | reduced serum media |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668027 | Reagent 1 |
| X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent | Roche | 6366236001 | Reagent 2 |
| DAPI Staining Solution | Beyotime | C1006 | |
| DiI | Beyotime | C1036 | |
| Antifade Mounting Medium | Beyotime | P0126 | |
| Paraformaldehyde | Sinopharm Chemical Reagent Co.(SCRC) | 80096618 | |
| 100 mm cell culture | CORNING | 430167 | |
| 6-well plate | ExCell Bio | CS016-0092 | |
| 12-well plate | ExCell Bio | CS016-0093 | |
| Cover Glass | NEST | 801007 | |
| Microscope Slides | Citoglas | 10127105P-G | |
| Thermo Scientific Forma CO2 Incubator | Thermo | 3111 | |
| TCS SP5II laser scanning confocal microscope | Leica | 5100001311 |
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