Aynı odaklı mikroskopi ile ligand-aktif G protein-eşli reseptör özümseme tespiti
Summary
Bu protokol, memeli hücrelerinde G-protein kenetli reseptör (GPCR) içselleştirmenin konfokal mikroskopi bağlanmasını anlatır. Temel hücre kültürü, transfeksiyon, ve konfokal mikroskopi prosedürü içeren füzyon ifade GPCR hücre içi lokalizasyonu ve içselleşmesini tespit etmek için etkin ve kolay yorumlanabilir bir yöntem sağlar.
Abstract
Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is an optical imaging technique for high-contrast imaging. It is a powerful approach to visualize fluorescent fusion proteins, such as green fluorescent protein (GFP), to determine their expression, localization, and function. The subcellular localization of target proteins is important for identification, characterization, and functional analyses. Internalization is one of the predominant mechanisms controlling G protein-coupled receptor (GPCR) signaling to ensure the appropriate cellular responses to stimuli. Here, we describe an experimental method to detect the subcellular localization and internalization of GPCR in HEK293 cells with confocal microscopy. In addition, this experiment provides some details about cell culture and transfection. This protocol is compatible with a variety of widely available fluorescent markers and is applicable to the visualization of the subcellular localization of a majority of proteins, as well as of the internalization of GPCR. This technique should enable researchers to efficiently manipulate GPCR gene expression in mammalian cell lines and should facilitate studies on GPCR subcellular localization and internalization.
Introduction
Hücreler taşımak için yük trafik mekanizmalara sahip hücre dışı malzemeler-tür ligandlar, mikroorganizmalar, besin ve zar-ötesi proteinden-bir bilgi, enerji ve diğer amaçlar 1, 2 hücre olarak. Hücresel homeostazı, doku işlevinin ve genel hücrenin hayatta kalması için kritik öneme sahiptir. Floresan füzyon proteinlerinin hücre bazlı ekspresyon yolları 3 sinyal lokalizasyonu ve G-protein bağlı reseptörler (GPCR), transmembran reseptörleri, internalizasyonunu incelemek için etkili bir yoldur.
Doğrudan floresans saptama teknikleri ile bir arada Aequorea victoria akvaryum balığındaki yeşil floresan protein (GFP) ile etiketlenmiş füzyon proteinlerinin ekspresyonu, geniş kabul görmüştür protein gibi araştırma 4, 5, 6. GFP tabanlı Detectiüzerinde sabitleme eserler 7 kaçınırken yaşayan hücrelerin gerçek zamanlı görüntüleme izin verme avantajına sahiptir. Çok yönlü klonlama vektörleri bir dizi, 9, çeşitli hücrelerde 8 GFP protein füzyonlarının ekspresyonunu kolaylaştırmak için inşa edilmiştir. pEGFP-N1 vektörü memeli hücrelerinde daha parlak floresans ve daha yüksek ifadesi için doğal tipte GFP arasından optimize edilmiş olan bir arttırılmış yeşil fluoresan protein (EGFP) kodlayan yaygın olarak kullanılan ve ticari olarak plazmid vektörüdür. EGFP flüoresan sinyal memeli hücrelerinde ifade gözlemlemek için, floresans mikroskopisi tercihen eş odaklı mikroskopi ile 488 nm'de eksitasyon ve 507 nm'de emisyon ile yapılmalıdır.
Hücre içi lokalizasyonu ve reseptörlerin ligand aracılı içselleştirme İzleme GPCR'lerin 10 sinyal iletimini ve araştırmak üzere yaygın bir tekniktir </s11,> yukarı. Bir çok durumda, internalizasyonunu GPCR'lerin duyarsızlaştırma (agonistlerin mevcudiyetinde rağmen teşvik cevabının hafifleme) 12, 13 neden olmaktadır. içsel reseptörleri lizozom dahil edilmiş ve bozulmuş ya da reseptörler ve deneylerde kullanılan hücre çizgilerinin yapısına bağlı olarak, hücre yüzeyine geri geri dönüştürülebilir edilebilir.
Gonadotropin salgılatıcı hormon reseptörleri (GnRHRs) GPCR familyasına aittir ve hücre dışı bir amino-terminali, bir hücre içi -COOH terminal ile, tipik bir GPCR protein yapısına sahip ve yedi zar-ötesi (TM) 14 alanlarla kullanılabilir. (Sepiella japonica gelen GnRHR geni ile) yeniden birleştirici plazmit Sj GnRHR-EGFP transfeksiyonu ve (HEK293 hücrelerinde ifade edilir) EGFP-etiketli Sj GnRHR konfokal mikroskopi tespit Previou bildirilmiştirsinsi ve GFP floresan transmembran protein lokalizasyonu deneyleri 15 muhabir olarak kurulmuştur. Şimdi, S. japonica gonadotropin salgılatıcı hormon (GnRH Sj) ile aktive Sj GnRHR içselleştirilmesi, eş odaklı mikroskopi ile zaman ve doza bağlı şekillerde gösterilmiştir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada sunulan protokol HEK293 hücrelerinde hücre içi lokalizasyonu ve eksprese GPCR füzyon proteininin internalizasyonunu tespit etmek için etkin ve kolay yorumlanabilir bir yöntem sağlar. Teknik kolayca HEK293 ve BMN hücreleri 16 Bombyx mori kaynaklı corazonin reseptörünün hücresel yerini ve internalizasyon için birçok farklı gen ve hücre tipleri için uyarlanabilir.
Bu güçlü testin başarılı uygulama birkaç anahtar faktöre dayanır….
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors of this paper would like to thank Prof. Jiayan Xie for technical assistance and equipment usage. This work was financially supported by the National Natural Science Foundation of China (41406137).
Materials
| HEK293 cell line | |||
| DMEM/High glucose | Hyclone | SH30022.01 | High glucose 4.0 mM L-glutamine |
| Foetal Bovine Serum (FBS) | PuFei | 1101-100 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Genom | GNM10010 | |
| Penicillin-Streptomycin | Genom | GNM15140 | |
| 0.25% Trypsin & 0.02% EDTA | Genom | GNM25200 | |
| Opti-MEM (1X) | GIBCO, by Life Technologies | 31985-062 | reduced serum media |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668027 | Reagent 1 |
| X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent | Roche | 6366236001 | Reagent 2 |
| DAPI Staining Solution | Beyotime | C1006 | |
| DiI | Beyotime | C1036 | |
| Antifade Mounting Medium | Beyotime | P0126 | |
| Paraformaldehyde | Sinopharm Chemical Reagent Co.(SCRC) | 80096618 | |
| 100 mm cell culture | CORNING | 430167 | |
| 6-well plate | ExCell Bio | CS016-0092 | |
| 12-well plate | ExCell Bio | CS016-0093 | |
| Cover Glass | NEST | 801007 | |
| Microscope Slides | Citoglas | 10127105P-G | |
| Thermo Scientific Forma CO2 Incubator | Thermo | 3111 | |
| TCS SP5II laser scanning confocal microscope | Leica | 5100001311 |
Referenzen
- Mellman, I. Endocytosis and molecular sorting. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 12, 575-625 (1996).
- Hausott, B., Klimaschewski, L. Membrane turnover and receptor trafficking in regenerating axons. Eur J Neuro. 43, 309-317 (2016).
- Kallal, L., Benovic, J. L. Using green fluorescent proteins to study G-protein-coupled receptor localization and trafficking. Trends Pharmacol Sci. 21, 175-180 (2000).
- Prasher, D. C., Eckenrode, V. K., Ward, W. W., Prendergast, F. G., Cormier, M. J. Primary structure of the Aequorea victoria green-fluorescent protein. Gene. 111, 229-233 (1992).
- Spector, D. L., Goldman, R. D. Constructing and Expressing GFP Fusion Proteins. CSH protocols. 2006, (2006).
- Drew, D. E., von Heijne, G., Nordlund, P., de Gier, J. W. Green fluorescent protein as an indicator to monitor membrane protein overexpression in Escherichia coli. FEBS Lett. 507, 220-224 (2001).
- von Arnim, A. G., Deng, X. W., Stacey, M. G. Cloning vectors for the expression of green fluorescent protein fusion proteins in transgenic plants. Gene. 221, 35-43 (1998).
- Webb, C. D., Decatur, A., Teleman, A., Losick, R. Use of green fluorescent protein for visualization of cell-specific gene expression and subcellular protein localization during sporulation in Bacillus subtilis. J Bacteriol. 177, 5906-5911 (1995).
- Kain, S. R., et al. Green fluorescent protein as a reporter of gene expression and protein localization. BioTechniques. 19, 650-655 (1995).
- Fukunaga, S., Setoguchi, S., Hirasawa, A., Tsujimoto, G. Monitoring ligand-mediated internalization of G protein-coupled receptor as a novel pharmacological approach. Life Sci. 80, 17-23 (2006).
- Yang, J., et al. Agonist-Activated Bombyx Corazonin Receptor Is Internalized via an Arrestin-Dependent and Clathrin-Independent Pathway. Biochemie. 55, 3874-3887 (2016).
- Kohout, T. A., Lefkowitz, R. J. Regulation of G protein-coupled receptor kinases and arrestins during receptor desensitization. Mol Pharmacol. 63, 9-18 (2003).
- Ferguson, S. S., et al. Role of beta-arrestin in mediating agonist-promoted G protein-coupled receptor internalization. Science. 271, 363-366 (1996).
- Stojilkovic, S. S., Reinhart, J., Catt, K. J. Gonadotropin-releasing hormone receptors: structure and signal transduction pathways. Endocr Rev. 15, 462-499 (1994).
- Yan, Y. J., et al. Identification and Expression Profile of the Gonadotropin-Releasing Hormone Receptor in Common Chinese Cuttlefish, Sepiella japonica. J Exp Zool A Ecol Genet Physiol. , (2016).
- Yang, J., et al. Specific activation of the G protein-coupled receptor BNGR-A21 by the neuropeptide corazonin from the silkworm, Bombyx mori, dually couples to the G(q) and G(s) signaling cascades. J Biol Chem. 288, 11662-11675 (2013).
- Lu, Z. M., et al. Cloning, Characterization, and Expression Profile of Estrogen Receptor in Common Chinese Cuttlefish, Sepiella japonica. J Exp Zool A Ecol Genet Physiol. 325, 181-193 (2016).
