Summary

Production de souris génétiquement modifiées par micro-injection d'ovocytes

Published: June 15, 2017
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Summary

La micro-injection d'ovocytes de souris est couramment utilisée à la fois pour la transgénèse classique ( c.-à-d. L'intégration aléatoire des transgènes) et le ciblage des gènes médié par CRISPR. Ce protocole examine les derniers développements en micro-injection, avec un accent particulier sur le contrôle de la qualité et les stratégies de génotypage.

Abstract

L'utilisation de souris génétiquement modifiées a contribué de manière significative aux études sur les processus physiologiques et pathologiques in vivo . L'injection pronucléaire des constructions d'expression d'ADN dans les ovocytes fécondés reste la technique la plus couramment utilisée pour générer des souris transgéniques pour une surexpression. Avec l'introduction de la technologie CRISPR pour le ciblage des gènes, l'injection pronucléaire dans les ovocytes fécondés a été étendue à la génération de souris knock-out et knockin. Ce travail décrit la préparation de l'ADN pour l'injection et la génération de guides CRISPR pour le ciblage des gènes, en mettant l'accent sur le contrôle de la qualité. Les procédures de génotypage nécessaires à l'identification des fondateurs potentiels sont essentielles. Des stratégies novatrices de génotypage qui profitent des capacités de "multiplexage" de CRISPR sont présentées ici. Les procédures chirurgicales sont également décrites. Ensemble, les étapes du protocole permettront la génération de genDes souris modifiées de manière sélective et pour l'établissement ultérieur de colonies de souris pour une pléthore de domaines de recherche, y compris l'immunologie, les neurosciences, le cancer, la physiologie, le développement et d'autres.

Introduction

Les modèles animaux, chez les vertébrés et les invertébrés, ont contribué à l'examen de la pathophysiologie des affections humaines telles que la maladie d'Alzheimer 1 , 2 . Ils sont également des outils précieux pour rechercher des modificateurs de maladies et pour finalement développer de nouvelles stratégies de traitement dans l'espoir d'un remède. Bien que chaque modèle ait des limites intrinsèques, l'utilisation des animaux comme modèles systémiques complets est essentielle à la recherche biomédicale. C'est parce que l'environnement physiologique métabolique et complexe ne peut pas être entièrement simulé dans la culture tissulaire.

À ce jour, la souris reste l'espèce de mammifère la plus commune utilisée pour la manipulation génétique car elle présente plusieurs avantages. Les processus physiologiques et les gènes associés aux maladies sont fortement conservés chez les souris et les humains. La souris a été le premier mammifère à avoir son génome complet séquencé (2002), un an avant le génome humainMoi (2003). Outre cette richesse de l'information génétique, la souris possède de bonnes capacités d'élevage, un cycle de développement rapide (6 semaines après la fertilisation jusqu'au sevrage) et une taille raisonnable. Tous ces avantages, couplés à des indicateurs physiologiques, tels que des couleurs de revêtement distinctes (requis pour les stratégies de croisement), ont fait de la souris un modèle attrayant pour la manipulation génétique. Notamment, au début de la génétique moderne, Gregor Mendel a commencé à travailler sur des souris avant de passer à des plantes 3 .

Les techniques de transfert de gènes ont entraîné la génération de la première souris transgénique il y a trois décennies 4 , initialement créée à l'aide de l'administration virale. Cependant, les chercheurs ont rapidement compris que l'un des principaux défis de la transgénèse de la souris était l'incapacité de contrôler le devenir de l'ADN exogène. Parce que l'administration virale de transgènes dans des ovocytes de souris a abouti à des copies multiples intégrées au hasard dans le génome, la possibilitéY d'établir des lignes transgéniques ultérieures était limité.

Une telle limitation a été surmontée lorsque Gordon et al. A généré la première ligne de souris transgénique par microinjection 5 , 6 . Cela a commencé l'ère de la technologie de l'ADN recombinant, et les paramètres influençant le résultat d'une session de micro-injection ont été largement étudiés 7 . Bien que la micro-injection ne permette pas le contrôle sur le site d'intégration du transgène (qui aboutit finalement à des niveaux d'expression spécifiques pour chaque souris fondatrice), l'avantage principal de la microinjection pronucléaire reste la formation de concatemers ( c.-à-d. Des tableaux de multiples copies du transgène, Liés en série) avant intégration génomique 5 . Cette caractéristique a été utilisée au cours des années pour établir des milliers de lignes de souris transgéniques qui surexpriment un gène d'intérêt. Depuis lors, la transgénèse, la aModification artificielle du génome d'un organisme, a été largement utilisée pour identifier le rôle des gènes simples dans l'apparition de maladies.

Une autre réalisation clé dans la manipulation du génome de la souris a été atteinte lorsque Mario Capecchi a perturbé avec succès un seul gène à la souris, ouvrant l'ère du ciblage des gènes 8 . Cependant, des inconvénients majeurs ont rapidement émergé du ciblage génétique basé sur les cellules ES, y compris les défis de la culture des cellules ES, le degré de chimérisme quelque peu variable et la durée du processus ( c'est-à-dire 12-18 mois minimum pour obtenir la souris) .

Récemment, les progrès dans les nouvelles technologies, telles que les endonucléases modifiées ( p. Ex., Les nucléases de doigts de zinc (ZFN), les nucléases effectrices de l'activateur de la transcription (TALEN) et les répétitions palindromiques courtes (CRISPR / Cas9) classées régulièrement sont apparues comme des méthodes alternatives Accélérer le processus de ciblage des gènes dans le microE 9 , 10 . Ces endonucléases peuvent être facilement injectées dans des ovocytes de souris par micro-injection, ce qui permet de générer des souris ciblées par gène en 6 semaines seulement.

Depuis le premier rapport sur l'utilisation de CRISPR pour l'édition génomique 11 , ce système immunitaire adaptatif bactérien a remplacé ZFN et TALEN en raison de ses nombreux avantages, y compris la facilité de la synthèse et la capacité de cibler de multiples loci à la fois (appelés "multiplexage" "). Le CRISPR a d'abord été utilisé pour le ciblage des gènes chez la souris 12 et a depuis été appliqué à d'innombrables espèces, des plantes aux humains 13 , 14 . À ce jour, aucun rapport d'une seule espèce n'est résistant à l'édition du génome CRISPR.

Les deux principales étapes limitantes de la génération de souris transgéniques sont l'injection d'ovocytes et la réimplantationDe ces ovocytes chez des femelles pseudo-grossières. Bien que cette technique ait été décrite par nous 15 et d'autres 16 , des améliorations techniques récentes dans l'embryologie de souris et les techniques de transfert de gènes ont révolutionné le processus de génération de souris génétiquement modifiées. Ces améliorations seront décrites ici.

Protocol

Toutes les procédures ont été approuvées par le Comité des soins et de l'éthique des animaux de l'Université de New-Galles du Sud. 1. Préparation du transgène (intégration aléatoire) Électrophorèse analytique en gel d'agarose. Décrivez le plasmide pour acciser le transgène en utilisant des enzymes appropriées (1 heure d'incubation) ou des enzymes à digestion rapide (15 à 30 minutes d'incubation) dans un thermocycleur …

Representative Results

Ci-dessous, les flux de travail pour la micro-injection dans le cas de l'intégration aléatoire et le ciblage des gènes médiés par CRISPR sont décrits ( Figure 1 ). Figure 1: Flux de travail typique pour la génération de souris génétiquement modifiées. Pour une intégration alé…

Discussion

Etapes critiques dans le protocole

On sait que la génération de souris génétiquement modifiées présente un défi technique. Cependant, le protocole présenté ici est une méthode optimisée et simplifiée qui permet de maîtriser et de dépanner la technique en un temps record. Il faut deux étapes pour réussir la technique. Tout d'abord, la synthèse de modèles d'ADN linéaires (pour la synthèse des sgRNA) peut être obtenue sans chlorure de magnésium (MgCl 2 ). C…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Les auteurs remercient le personnel de l'établissement animal (BRC) pour leur soutien continu. Ce travail a été financé par le National Health and Medical Research Council et le Australian Research Council.

Materials

Micropipette 0.1-2.5 ul Eppendorf 4920000016
Micropipette 2-20 ul Eppendorf 4920000040
Micropipette 20-200 ul Eppendorf 4920000067
Micropipette 100-1000 ul Eppendorf 4920000083
Molecular weight marker  Bioline BIO-33025 HyperLadder 1kb
Molecular weight marker  Bioline BIO-33056 HyperLadder 100 bp
Agarose Bioline BIO-41025
EDTA buffer Sigma-Aldrich 93296 10x – Dilute to 1x
Ethidium bromide Thermo Fisher Scientific 15585011
SYBR Safe gel stain Invitrogen S33102
Gel extraction kit Qiagen 28706
PCR purification kit (Qiaquick) Qiagen 28106
Vacuum system (Manifold) Promega A7231
Nuclease-free microinjection buffer  Millipore MR-095-10F
Ultrafree-MC microcentrifuge filter  Millipore UFC30GV00
Cas9 mRNA Sigma-Aldrich CAS9MRNA
CRISPR expressing plasmid (px330) Addgene 42230
Nuclease free water Sigma-Aldrich W4502
Phusion polymerase New England Biolabs M0530L
T7 Quick High Yield RNA kit New England Biolabs E2050S
RNA purification spin columns (NucAway) Thermo Fisher Scientific AM10070
ssOligos Sigma-Aldrich OLIGO STANDARD
Donor plasmid Thermo Fisher Scientific GeneArt
Hyaluronidase Sigma-Aldrich H3884
KSOMaa embryo culture medium Zenith Biotech  ZEKS-100
Mineral oil Zenith Biotech  ZSCO-100
M2 Medium Sigma-Aldrich M7167
Cytochalasin B Sigma-Aldrich C6762
Mouthpiece Sigma-Aldrich A5177
Glass microcapillaries Sutter Instrument BF100-78-10
Proteinase K Applichem A3830.0100
Dumont #5 forceps Fine Science Tools  91150-20
Iris scissors Fine Science Tools  91460-11
Vessel clamp Fine Science Tools  18374-43
Wound clips  Fine Science Tools  12040-01
Clips applier  Fine Science Tools  12018-12
Micro-scissors  Fine Science Tools  15000-03
Cauterizer Fine Science Tools  18000-00
Non-absorbable surgical sutures (Ethilon 3-0) Ethicon 1691H
5% CO2 incubator MG Scientific Galaxy 14S
Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific Nanodrop 2000c
Thermocycler Eppendorf 6321 000.515
Electrophoresis set up BioRad 1640300
UV Transilluminator BioRad 1708110EDU
Thermocycler Eppendorf 6334000069
Stereoscopic microscope Olympus SZX7
Inverted microscope Olympus IX71
2x Micromanipulators Eppendorf 5188000.012
Oocytes manipulator Eppendorf 5176000.025
Microinjector (Femtojet) Eppendorf 5247000.013
Mice C57BL/6J strain Australian BioResources C57BL/6JAusb 

Referenzen

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Diesen Artikel zitieren
Delerue, F., Ittner, L. M. Generation of Genetically Modified Mice through the Microinjection of Oocytes. J. Vis. Exp. (124), e55765, doi:10.3791/55765 (2017).

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