Histon Antikor Özgüllüğünün Peptit Mikroarraylerle Analizi
Summary
Bu el yazısı, histonları ve bunların translasyon sonrası modifikasyonlarını tanıyan antikorların spesifiklik profiline peptid mikroarray teknolojisinin uygulanması için yöntemleri açıklamaktadır.
Abstract
Histon proteinleri üzerindeki translasyon sonrası modifikasyonlar (PTM'ler), kromatin yapısını ve gen ekspresyonunu düzenleme rolleri için geniş çapta incelenmektedir. Histon PTM'lerine spesifik antikorların seri olarak üretilmesi ve dağıtımı, bu işaretler üzerinde araştırmayı büyük ölçüde kolaylaştırdı. Histon PTM antikorları, birçok kromatin biyokimya uygulaması için önemli reaktifler olduğundan, doğru veri yorumlaması ve sahadaki ilerlemenin devam etmesi için antikor özgüllüğünün titiz analizi gereklidir. Bu protokol, histone antikorlarının spesifikliğini profillemek için peptit mikrodizilerinin tasarım, imalat ve kullanımı için entegre bir boru hattı tarif eder. Bu prosedürün tasarım ve analiz yönleri ArrayNinja tarafından kolaylaştırılmış ve açık kaynaklı ve etkileşimli bir yazılım paketi, son zamanlarda mikroarray baskı formatlarının uyarlanmasını hızlandırmak için geliştirdi. Bu boru hattı, piyasada bulunan ve yaygın olarak kullanılan histon PTM antibodisinin çok sayıda taranması için kullanılmıştırS ve bu deneylerden elde edilen veriler çevrimiçi ve genişletici bir Histon Antikor Özgüllilik Veritabanı aracılığıyla serbestçe elde edilebilir. Histonların ötesinde, burada açıklanan genel metod, PTM'ye spesifik antikorların analizine genel olarak uygulanabilir.
Introduction
Genomik DNA, kromatin oluşturmak için ökaryotik hücre çekirdeğinin içinde histon proteinleri ile zarif bir şekilde paketlenmiştir. Kromatin tekrarlayan altbirimi, H2A, H2B, H3 ve H4 1 oktamerik bir çekirdek histon proteinleri etrafında sarılan 147 baz çift DNA'dan oluşan nükleozomdur. Kromatin genel olarak gevşek biçimde paketlenmiş ökromatin ve yoğun sıkıştırılmış heterokromatin alanlar halinde düzenlenir. Kromatin sıkıştırma derecesi, protein makineleri, kopyalama, kopyalama ve onarım gibi temel DNA şablonlu işlemleri gerçekleştirmek için altta yatan DNA'ya ne ölçüde erişebildiğini düzenler.
Genetik erişilebilirliğin kromatin bağlamındaki kilit düzenleyicileri histon proteinlerinin yapılandırılmamış kuyruk ve çekirdek alanlarındaki 2 , 3 PTM'leridir. Histon PTM'leri doğrudan kromatin 4'ün yapısını etkiler ve dolaylı olarak işlev görürlerh okuyucu proteinleri ve kromatin remodeling, enzimatik ve iskele aktivitelerini 5 sahip ilişkili makromoleküler kompleksler işe. Son iki on yılda histon PTM fonksiyonu üzerine yapılan çalışmalar, bu işaretlerin hücre akıbetini, organizma gelişimini ve hastalık başlatma / ilerlemesini düzenleyen önemli rol oynadığını göstermektedir. Kütle spektrometresi tabanlı proteomik teknolojideki ilerlemelerle beslenen 80'den fazla farklı histon artıkları üzerinde 20'den fazla benzersiz histon PTM'si keşfedildi 6 . Özellikle, bu modifikasyonlar sıklıkla kombinasyon halinde ortaya çıkmakta ve "histon kodu" hipotezi ile tutarlı bir şekilde sayısız araştırma, histon PTM'lerinin 7 , 8 , 9'un spesifik kombinasyonlarının tanınması yoluyla okuyucu proteinlerinin farklı kromatin bölgelerini hedef aldığını göstermektedir. Önemli bir zorluk, işlevleri GrHistone PTM'lerinin listesine bağlı olarak ve belirli histone PTM kombinasyonlarının kromatin ile ilişkili dinamik fonksiyonları nasıl düzenlediğini belirlemek için kullandı.
Antikorlar, histon PTM'lerinin tespiti için linç pinin reaktifleridir. Bu nedenle, kromatin biyokimya araştırmasında kullanılmak üzere 1.000'den fazla histon PTM'ye spesifik antikor ticari olarak geliştirilmiştir. Yüksek verimli DNA dizileme teknolojisinin hızlı gelişimi ile bu reaktifler, ChIP-seq'deki bireysel araştırmacılar ve büyük ölçekli epigenomik "yol haritası" girişimleri ( örn. , ENCODE ve BLUEPRINT) tarafından geniş ölçüde kullanılmaktadır (kromatin immüno çökeltme, yeni nesil sıralama ) Histonun yüksek çözünürlüklü mekânsal haritalarını üretmek için boru hatları PTM dağıtım genomu genişliği 10 , 11 . Bununla birlikte, son çalışmalar histon PTM antikorlarının özgüllüğünün oldukça değişken olduğunu ve bu reaktiflerin unf Hedef dışı epitop tanıma, komşu PTM'ler tarafından güçlü pozitif ve negatif etki ve belirli bir kalıntı ( örn. , Mono-, di- veya tri-metillisin) 12 , 13 , 14 , 15'deki modifikasyon sırasını ayırt etme zorluğu gibi avorable özellikler , 16 , 17 , 18 . Bu nedenle, bu değerli reaktiflerle üretilen verileri doğru bir şekilde yorumlamak için histon PTM'ye özgü antikor reaktiflerinin titiz kalite kontrolü gereklidir.
Mikroarray teknolojisi, binlerce makromoleküler etkileşimin aynı anda yüksek verimli, tekrarlanabilir ve minyatür formatta sorgulanmasını sağlar. Bu nedenle protein-DNA 19'u analiz etmek için çeşitli mikrodizim platformları yaratılmıştır ,"> 20, protein-protein 21 ve protein-peptid etkileşimlerinin 22. Gerçekten de, histon peptid mikrodizileri yazarlar, silgi yüksek verimli profil sağlayan kromatin biyokimya araştırma için bilgi keşif platformu olarak ortaya çıktı ve histonun okuyucuları PTMS 15 adres , 23 , 24 ve ayrıca histone antikor özgünlüğünün analizi için 17 , 25. Histon peptit dizileri, kromatin ve epigenetik araştırmalarının ötesinde, sistemik lupus eritematosus ve diğer otoimmün hastalıkların teşhis / prognostik testi olarak potansiyel bir kullanıma sahiptir; kromatin otoantikorları, 27 26 oluşturulur.
Burada, tasarım, imalat ve que için geliştirdiğimiz entegre bir boru hattı tanımlıyoruzHistonları ve PTM'lerini tanıyan antikorlar için özgüllük profilleri üretmek için histon peptidi mikrodizileri kullandı. Boru hattı, yakın zamanda geliştirdiğimiz, mikroarray deneylerinin tasarım ve analiz aşamalarını bütünleştiren, açık kaynaklı ve interaktif bir yazılım uygulaması olan ArrayNinja tarafından kolaylaştırıldı 28 . ArrayNinja, Google Chrome'da en iyi şekilde çalışır. Kısacası, streptavidin kaplı cam mikroskop lamlarında belirli bir konumda biyotinle konjuge edilmiş histone peptidlerinin bir kütüphanesinin depolanması için bir robotik temas mikrodizisi yazıcı kullanılır. Ardından diziler, antikor-epitop etkileşimlerini sorgulamak için rekabetçi ve paralel bir tahlil formunda kullanılabilir ( Şekil 1 ). Peptid kütüphanesi, tek başına PTM'leri (lizin asetilasyonu, lisin / arginin metilasyonu ve serin / treonin fosforilasyonu) içeren yüzlerce benzersiz sentetik peptid ve büyük oranda proteomik veri kümelerinden türetilen ilgili kombinasyonlardan oluşur. Peptid sentezi ve geçerliliği için yöntemler Başka yerlerde detaylandırılmıştır 23 . Bu dizilim platformunu kullanarak halen devam eden histon PTM antikor tarama çabalarımızdan elde edilen veriler, halka açık bir web kaynağı, Histone Antikor Özgüllilik Veritabanı (www.histoneantibodies.com) üzerinde arşivlenir. Özellikle, bu protokolün çeşitlemeleri ile imal edilen histon peptit mikroarrayleri, histon PTM okuyucu alanlarının 8 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 ve daha yakın zamanda profil histonuna aktivitesini karakterize etmek için yaygın bir şekilde kullanılmıştır PTM yazar ve silgi faaliyetleri 24 .
/files/ftp_upload/55912/55912fig1.jpg "/>
Şekil 1: Bir Histone Peptid mikroarrayinde Antikor Taramasının Kademeli Prosedürünün Çizgi Film Tasvirleri. Tanımlanmış translasyon sonrası modifikasyonları (kırmızı ve mavi daireler) barındıran biyotinlenmiş histon peptidleri, streptavidin kaplı cam üzerinde biyotin-floresein ile birlikte basılmıştır. Pozitif etkileşimler kırmızı floresans olarak görselleştirilir. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Protocol
Representative Results
Discussion
Biyomedikal araştırma uygulamalarında antikor güvenilirliği en iyisi 46 , 47 . Bu, özellikle histamin PTM'lerinin bolluğu ve dağılımını karakterize etmek için geliştirilen teknikler için anahtar araçlar olarak antikorların bulunduğu kromatin biyokimyasında geçerlidir. Burada sunulan protokol, histon PTM antikor özgünlüğünü analiz etmek için peptit mikrodizilerinin tasarım, imalat ve kullanımı için optimize edilmiş bir boru hat…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma kısmen Van Andel Araştırma Enstitüsü ve Ulusal Sağlık Enstitüsünden (CA181343) SBR'e verilen bir araştırma ödeneği ile desteklendi
Materials
| Printing Buffer | ArrayIt | PPB | |
| BSA | Omnipure | 2390 | |
| Streptavidin-coated glass microscope slides | Greiner Bio-one | 439003-25 | |
| polypropylene 384 well plate | Greiner Bio-one | 784201 | |
| Biotin-fluorescein | Sigma | 53608 | |
| contact microarray printer | Aushon | 2470 | Aushon 2470 Microarray Printer |
| contact microarray printer | Gene Machines | OmniGrid 100 | OmniGrid Microarray Printer |
| PBS | Invitrogen | 14190 | |
| Blocking Buffer | ArrayIt | SBB | |
| Hydrophobic wax pen | Vector Labs | H-4000 | ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen |
| Silicon Gasket | Grace Bio-labs | 622511 | |
| Hybridization Vessel | Thermo Scientific | 267061 | or similar vessel |
| Fluorescent-dye conjugated secondary antibody | Life Technologies | A-21244 | Alexa Fluor 647 (anti-rabbit) |
| Fluorescent-dye conjugated secondary antibody | Life Technologies | A-21235 | Alexa Fluor 647 (anti-mouse) |
| Wax Imprinter | ArrayIt | MSI48 | |
| Tween-20 | Omnipure | 9490 | |
| Microarray Scanner | Innopsys | InnoScan 1100AL | or equivalent microarray scanner |
| EipTitan Histone Peptide Microarray | Epicypher | 112001 | |
| AbSurance Pro Histone Peptide Microarray | Millipore | 16668 | |
| MODified Histone Peptide Array | Active Motif | 13001 | |
| Histone Code Peptide Microarrays | JPT | His_MA_01 | |
| Wax | Royal Oak | GulfWax | for wax imprinter |
| Humidified Microarray Slide Hybridization Chamber | VWR | 97000-284 | |
| High throughput microscope slide washing chamber | ArrayIt | HTW | |
| Microscope slide centrifuge | VWR | 93000-204 | |
| Antibody 1 | Abcam | 8898 | |
| Antibody 2 | Millipore | 07-473 | |
| Biotinylated histone peptide | EpiCypher | 12-0001 | Example peptide. Similar peptides with various modifications are available from several commercial sources. |
| ImageMagick | https://www.imagemagick.org/script/index.php | ||
| ArrayNinja | https://rothbartlab.vai.org/tools/ |
Referenzen
- van Steensel, B. Chromatin: constructing the big picture. EMBO J. 30 (10), 1885-1895 (2011).
- Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128 (4), 693-705 (2007).
- Rothbart, S. B., Strahl, B. D. Interpreting the language of histone and DNA modifications. Biochim Biophys Acta. 1839 (8), 627-643 (2014).
- Shogren-Knaak, M., Ishii, H., Sun, J. -. M., Pazin, M. J., Davie, J. R., Peterson, C. L. Histone H4-K16 acetylation controls chromatin structure and protein interactions. Science. 311 (5762), 844-847 (2006).
- Musselman, C. A., Lalonde, M. -. E., Côté, J., Kutateladze, T. G. Perceiving the epigenetic landscape through histone readers. Nat Struct Mol Biol. 19 (12), 1218-1227 (2012).
- Huang, H., Sabari, B. R., Garcia, B. A., Allis, C. D., Zhao, Y. SnapShot: Histone Modifications. Cell. 159 (2), 458 (2014).
- Strahl, B. D., Allis, C. D. The language of covalent histone modifications. Nature. 403 (6765), 41-45 (2000).
- Rothbart, S. B., Krajewski, K., et al. Association of UHRF1 with methylated H3K9 directs the maintenance of DNA methylation. Nat Struct Mol Biol. 19 (11), 1155-1160 (2012).
- Wang, Z., Zang, C., et al. Combinatorial patterns of histone acetylations and methylations in the human genome. Nat Genet. 40 (7), 897-903 (2008).
- Stunnenberg, H. G., Hirst, M. The International Human Epigenome Consortium: A Blueprint for Scientific Collaboration and Discovery. Cell. 167 (5), 1145-1149 (2016).
- ENCODE Project Consortium. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
- Egelhofer, T. A., Minoda, A., et al. An assessment of histone-modification antibody quality. Nat Struct Mol Biol. 18 (1), 91-93 (2011).
- Bock, I., Dhayalan, A., Kudithipudi, S., Brandt, O., Rathert, P., Jeltsch, A. Detailed specificity analysis of antibodies binding to modified histone tails with peptide arrays. Epigenetics. 6 (2), 256-263 (2011).
- Busby, M., Xue, C., et al. Systematic comparison of monoclonal versus polyclonal antibodies for mapping histone modifications by ChIP-seq. Epigenetics Chromatin. 9, 49 (2016).
- Fuchs, S. M., Krajewski, K., Baker, R. W., Miller, V. L., Strahl, B. D. Influence of combinatorial histone modifications on antibody and effector protein recognition. Curr Biol. 21 (1), 53-58 (2011).
- Kungulovski, G., Jeltsch, A. Quality of histone modification antibodies undermines chromatin biology research. F1000Research. 4, 1160 (2015).
- Rothbart, S. B., Dickson, B. M., et al. An Interactive Database for the Assessment of Histone Antibody Specificity. Mol Cell. 59 (3), 502-511 (2015).
- Rothbart, S. B., Lin, S., et al. Poly-acetylated chromatin signatures are preferred epitopes for site-specific histone H4 acetyl antibodies. Sci Rep. 2, 489 (2012).
- Berger, M. F., Bulyk, M. L. Universal protein-binding microarrays for the comprehensive characterization of the DNA-binding specificities of transcription factors. Nat Protoc. 4 (3), 393-411 (2009).
- Hu, S., Wan, J., et al. DNA methylation presents distinct binding sites for human transcription factors. eLife. 2, e00726 (2013).
- Moore, C. D., Ajala, O. Z., Zhu, H. Applications in high-content functional protein microarrays. Curr Opin Chem Biol. 30, 21-27 (2016).
- MacBeath, G., Schreiber, S. L. Printing proteins as microarrays for high-throughput function determination. Science. 289 (5485), 1760-1763 (2000).
- Rothbart, S. B., Krajewski, K., Strahl, B. D., Fuchs, S. M. Peptide microarrays to interrogate the “histone code” . Methods Enzymol. 512, 107-135 (2012).
- Cornett, E. M., Dickson, B. M., et al. Substrate Specificity Profiling of Histone-Modifying Enzymes by Peptide Microarray. Methods Enzymol. 574, 31-52 (2016).
- Nady, N., Min, J., Kareta, M. S., Chédin, F., Arrowsmith, C. H. A SPOT on the chromatin landscape? Histone peptide arrays as a tool for epigenetic research. Trends Biochem Sci. 33 (7), 305-313 (2008).
- Dieker, J., Berden, J. H., et al. Autoantibodies against Modified Histone Peptides in SLE Patients Are Associated with Disease Activity and Lupus Nephritis. PLoS ONE. 11 (10), (2016).
- Price, J. V., Tangsombatvisit, S., et al. “On silico” peptide microarrays for high-resolution mapping of antibody epitopes and diverse protein-protein interactions. Nat Med. 18 (9), 1434-1440 (2012).
- Dickson, B. M., Cornett, E. M., Ramjan, Z., Rothbart, S. B. ArrayNinja: An Open Source Platform for Unified Planning and Analysis of Microarray Experiments. Methods Enzymol. 574, 53-77 (2016).
- Gatchalian, J., Fütterer, A., et al. Dido3 PHD modulates cell differentiation and division. Cell Rep. 4 (1), 148-158 (2013).
- Cai, L., Rothbart, S. B., et al. An H3K36 methylation-engaging Tudor motif of polycomb-like proteins mediates PRC2 complex targeting. Mol Cell. 49 (3), 571-582 (2013).
- Rothbart, S. B., Dickson, B. M., et al. Multivalent histone engagement by the linked tandem Tudor and PHD domains of UHRF1 is required for the epigenetic inheritance of DNA methylation. Genes Dev. 27 (11), 1288-1298 (2013).
- Ali, M., Rincón-Arano, H., et al. Molecular basis for chromatin binding and regulation of MLL5. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (28), 11296-11301 (2013).
- Kinkelin, K., Wozniak, G. G., Rothbart, S. B., Lidschreiber, M., Strahl, B. D., Cramer, P. Structures of RNA polymerase II complexes with Bye1, a chromatin-binding PHF3/DIDO homologue. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (38), 15277-15282 (2013).
- Klein, B. J., Piao, L., et al. The histone-H3K4-specific demethylase KDM5B binds to its substrate and product through distinct PHD fingers. Cell Rep. 6 (2), 325-335 (2014).
- Kim, H. -. S., Mukhopadhyay, R., et al. Identification of a BET family bromodomain/casein kinase II/TAF-containing complex as a regulator of mitotic condensin function. Cell Rep. 6 (5), 892-905 (2014).
- Greer, E. L., Beese-Sims, S. E., et al. A histone methylation network regulates transgenerational epigenetic memory in C. elegans. Cell Rep. 7 (1), 113-126 (2014).
- Andrews, F. H., Tong, Q., et al. Multivalent Chromatin Engagement and Inter-domain Crosstalk Regulate MORC3 ATPase. Cell Rep. 16 (12), 3195-3207 (2016).
- Sidoli, S., Lin, S., Karch, K. R., Garcia, B. A. Bottom-Up and Middle-Down Proteomics Have Comparable Accuracies in Defining Histone Post-Translational Modification Relative Abundance and Stoichiometry. Anal Chem. 87 (6), 3129-3133 (2015).
- Tsukada, Y., Ishitani, T., Nakayama, K. I. KDM7 is a dual demethylase for histone H3 Lys 9 and Lys 27 and functions in brain development. Genes Dev. 24 (5), 432-437 (2010).
- Tachibana, M., Sugimoto, K., Fukushima, T., Shinkai, Y. Set domain-containing protein, G9a, is a novel lysine-preferring mammalian histone methyltransferase with hyperactivity and specific selectivity to lysines 9 and 27 of histone H3. J Biol Chem. 276 (27), 25309-25317 (2001).
- Wu, H., Chen, X., et al. Histone methyltransferase G9a contributes to H3K27 methylation in vivo. Cell Res. 21 (2), 365-367 (2011).
- Koch, C. M., Andrews, R. M., et al. The landscape of histone modifications across 1% of the human genome in five human cell lines. Genome Res. 17 (6), 691-707 (2007).
- Okitsu, C. Y., Hsieh, J. C. F., Hsieh, C. -. L. Transcriptional Activity Affects the H3K4me3 Level and Distribution in the Coding Region. Mol Cell Biol. 30 (12), 2933-2946 (2010).
- Zentner, G. E., Tesar, P. J., Scacheri, P. C. Epigenetic signatures distinguish multiple classes of enhancers with distinct cellular functions. Genome Res. 21 (8), 1273-1283 (2011).
- Garske, A. L., Oliver, S. S., et al. Combinatorial profiling of chromatin binding modules reveals multisite discrimination. Nat Chem Biol. 6 (4), 283-290 (2010).
- Baker, M. Reproducibility crisis: Blame it on the antibodies. Nature. 521 (7552), 274-276 (2015).
- Bradbury, A., Plückthun, A. Reproducibility: Standardize antibodies used in research. Nature. 518 (7537), 27-29 (2015).
- Nguyen, U. T. T., Bittova, L., et al. Accelerated chromatin biochemistry using DNA-barcoded nucleosome libraries. Nat Methods. 11 (8), 834-840 (2014).
- Frank, R. Spot-synthesis: an easy technique for the positionally addressable, parallel chemical synthesis on a membrane support. Tetrahedron. 48 (42), 9217-9232 (1992).
- Hilpert, K., Winkler, D. F. H., Hancock, R. E. W. Peptide arrays on cellulose support: SPOT synthesis, a time and cost efficient method for synthesis of large numbers of peptides in a parallel and addressable fashion. Nat Protoc. 2 (6), 1333-1349 (2007).
- Kudithipudi, S., Kusevic, D., Weirich, S., Jeltsch, A. Specificity analysis of protein lysine methyltransferases using SPOT peptide arrays. J Vis Exp. (93), e52203 (2014).
