אין ויוו הדמיה של עכברים כתב Cx3cr1gfp/gfp עם תחומים הספקטרום טומוגרפיה אופטית קוהרנטית, סריקת לייזר Ophthalmoscopy

Summary

פרוטוקול זה מתאר איך ברזולוציה גבוהה טכניקות הדמיה כגון טומוגרפיה אופטית קוהרנטית בתחום ספקטרלי, סריקת לייזר ophthalmoscopy יכול להיות מנוצל מכרסמים קטנים, באמצעות מערכת פלטפורמה אופטלמולוגיות הדמיה, כדי לקבל מידע על עובי רשתית, microglial תא הפצה, בהתאמה.

Abstract

טומוגרפיה אופטית קוהרנטית בתחום ספקטרלי (SD-אוקטובר) ו לייזר סריקה ophthalmoscopy (סלו) נמצאים בשימוש נרחב אופתלמולוגיה ניסיוני. בפרוטוקול הנוכחי, עכברים המבטאים ירוק (gfp) חלבון פלואורסצנטי תחת האמרגן של Cx3cr1 (BALB/c-Cx3cr1^gfp/gfp) שימשו כדי התמונה מיקרוגלייה תאים ויוו ברשתית. מיקרוגלייה מקרופאגים תושב של הרשתית, היו מעורבים מספר מחלות רשתית^1,2,3,4,5,6. פרוטוקול זה מספקת גישה מפורטת לדור של B-הרשתית, עם SD-אוקטובר, הדמיה של התפלגות התא מיקרוגלייה בעכברים Cx3cr1^gfp/gfp עם סלו ויוו, באמצעות מערכת פלטפורמה אופטלמולוגיות הדמיה. הפרוטוקול יכול לשמש במספר שורות העכבר הכתב. עם זאת, ישנן כמה מגבלות בפרוטוקול המוצג כאן. ראשית, סלו וגם SD-אוקטובר, כאשר נעשה שימוש במצב ברזולוציה גבוהה, איסוף הנתונים עם מפוח ברזולוציה גבוהה אבל הרזולוציה לרוחב הוא נמוך (מיקרומטר 3.5 ו- 6 מיקרומטר, בהתאמה). יתר על כן, רמת המיקוד ורוויה סלו תלויה מאוד מבחר פרמטר, יישור נכון של העין. בנוסף, באמצעות התקנים שנועדו עבור חולים אנושיים בעכברים הוא מאתגר עקב גבוה סך כל הכוח האופטי של העין העכבר לעומת העין האנושית; זה יכול להוביל לרוחב ההגדלה אי דיוקים⁷, אשר תלויים גם ההגדלה שהעדשה העכבר בין היתר. עם זאת, למרות הסורק צירית במצב הזה הוא תלוי הגדלה לרוחב, המדידות SD-אוקטובר צירית מדויק⁸.

Introduction

עיניים ניסיוני, בחינת פתולוגיה ברשתית מחושבת בדרך כלל באמצעות טכניקות היסטולוגית. עם זאת, היסטולוגיה דורש euthanization בעלי חיים, עלול לגרום שינוי במאפיינים בפועל של הרקמה. SD-אוקטובר, סלו נעשה שימוש באופן שגרתי עיניים קליניים למטרות אבחון ועל הפיקוח על מחלות רשתית מספר כגון בצקת מקולרית סוכרתית⁹, קדמית נוירופתיה אופטית איסכמי¹⁰או רטיניטיס פיגמנטוזה¹¹ . SD-אוקטובר סלו טכניקות פולשני להפיק תמונות ברזולוציה גבוהה של הרשתית, אשר הם דמיינו דרך האישון מורחבים ללא התערבות נוספת בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד. SD-אוקטובר מספק מידע של מבנה הרשתית ועובי הרשתית על ידי איסוף נתונים backscattering כדי ליצור תמונות חתך של הרשתית, בעוד סלו אוספת נתונים זריחה כדי להפיק תמונות חדות גבוהה סטריאוסקופי של הרשתית. כיום, בשתי הטכניקות משמשות יותר ויותר ניסיוני עיניים באמצעות מכרסמים קטנים^12,13,14,15 (או אפילו דג זברה^16,17) ויכול לספק גם מידע כמותיים^{12,17,18,19,20,21}.

הצטברות של אנדוגני fluorophores כמו lipofuscins או היווצרות של drusen ברשתית, ניתן לאבחן על ידי סלו כמו האות פלורסנט אוטומטית. תכונה זו הופכת סלו טכניקה יקר עבור אבחון וניטור של מחלות רשתית כמו ניוון מקולרי הקשור לגיל או רטיניטיס פיגמנטוזה^22,23. עיניים ניסיוני, זריחה אוטומטי הדמיה (AF) יכול לשמש עבור זיהוי סוגי תאים מסוים בקווים העכבר הכתב. לדוגמה, עכברים משפחתית ולא משפחתית הטרוזיגוטיים עבור הביטוי של ה-gfp תחת האמרגן של Cx3cr1²⁴ הם יתרון עבור ויזואליזציה ויוו microglial תאים ברשתית נורמלי, החקירה של מיקרוגלייה/מקרופאג הדינמיקה של מחלות רשתית²¹. מיקרוגלייה הן המקרופאגים תושב של הרשתית, אשר לשחק תפקיד מכריע על הומאוסטזיס רקמות ותיקון רקמות על פציעה^1,25,26. מיקרוגלייה הפעלת ב הרשתית דווחה פגיעה ברשתית, איסכמיה, ניוון, רומז תפקיד של תאים אלה מחלות רשתית^{2,3,4,5, 6}.

מטרת הפרוטוקול הנוכחי היא לתאר שיטה פשוטה יחסית עבור הדמיה ברשתית ומדידה של עובי הרשתית בעזרת SD-אוקטובר ועבור ויזואליזציה של תאים מיקרוגלייה חיובי gfp באמצעות העכבר Cx3cr1^gfp/gfp רשתית סלו (היידלברג Spectralis HRA + OCT מערכת). פרוטוקול זה יכול להיות מנוצל עבור מדידות הדמיה ועובי של הרשתית בריא או חולה בקווים העכבר שונים. בנוסף, ניתן לבצע ניתוחים morphometric עבור וכימות של מספרים מיקרוגלייה והפעלה מיקרוגלייה ברשתית באמצעות סלו²¹. מיקרוגלייה התאים קשורים עם מחלות ניווניות של מערכת העצבים המרכזית (CNS), כולל^28,27,29הרשתית. כך, על ידי שילוב של שתי השיטות בשימוש בפרוטוקול הנוכחי, המתאם של מיקרוגלייה הפצה, ניוון הרשתית יכול להתבצע, אשר יכול להקל על חומרת המחלה ניטור או יעילות טיפולית גישות vivo.

Protocol

בכל ההליכים, BALB/c למבוגרים זכר ונקבה של עכברים אקספרס gfp תחת האמרגן של Cx3cr1 היו בשימוש 24. עכברים טופלו על-פי ארוו שימוש בבעלי חיים של לרפואת עיניים ומחקר חזון ואושרו בכל ההליכים מהממשלה השוויצרי על פי הוראות השוויצרי הפדראלי על צער. עכברים היו ומורדמת באמצעות זריקה תת עורי?…

Representative Results

באמצעות פרוטוקול המובאת כאן, SD-אוקטובר ואבחון סלו תמונות התקבלו Cx3cr1gfp/gfp עכברים במהלך אותה הפעלה של הדמיה. איור 3 כולל SD נציג-סריקות יחיד שהושג עם 30 מעלות או עדשה 55 ° (איור 3 א) ותמונות סלו נציג שהושג עם 55 ° או עדשה 102 °, איפה הם דמיינ?…

Discussion

המאמר הנוכחי מדגים פרוטוקול עבור הרכישה של הרשתית B והדמיה של הפצה חיובית מיקרוגלייה gfp ברשתית העכבר במהלך אותה הפעלה של הדמיה. SD-אוקטובר, סלו משמשים יותר ויותר במודלים חייתיים של מחלות רשתית לספק מידע של שינויים ברשתית מעל הזמן^{10,14,17,</sup…}

Materials

Spectralis Imaging system (HRA+OCT)	Heidelberg Engineering, Germany	N/A	ophthalmic imaging platform system
Heidelberg Eye Explorer	Heidelberg Engineering, Germany	N/A	Version 1.9.13.0
78D standard ophthalmic non-contact slit lamp lens	Volk Optical Inc., Ohio, USA	V78C
Spectralis wide angle 55° lens	Heidelberg Engineering, Germany	50897-002
ultra widefield 102° lens	Heidelberg Engineering, Germany	50117-001
medetomidine hydrochloride 1 mg/mL (Domitor)	Provet AG, Lyssach, Switzerland	Swissmedic Nr. 50'590 – ATCvet: QN05CM91	anesthetic/analgesic
ketamine 50mg/ml (Ketalar)	Parke-Davis, Zurich, Switzerland	72276388	anesthetic
tropicamide 0.5% + phenylephrine HCl 2.5% (Augentropfen mix)	ISPI, Bern, Switzerland	N/A	pupil dilation
Omnican Insulin-50 0.5 ml G30 0.3 x 12mm	B. Braun Mesungen AG, Carl-Braun-Straße, Germany	9151125
hydroxypropylmethylcellulose (Methocel 2%)	OmniVision, Neuhausen, Switzerland	N/A
+4 dpt rigid gas permeable contact lens	Quantum I, Bausch + Lomb Inc., Rochester, NY	N/A	Base Curve: 7.20 to 8.40 mm Diameter: 9.00 / 9.60 / 10.20 mm Power: -25.00 to +25.00 Diopters
balanced salt solution (BSS)	Inselspital, Bern, Switzerland	N/A
silicon forceps	N/A	N/A
atipamezole 5 mg/mL (Antisedan)	Provet AG, Lyssach, Switzerland	N/A	α2 adrenergic receptor antagonist
GraphPad Prism 7	GraphPad Software, Inc, San Diego, CA, USA	N/A	statistical analysis software