JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Ergebnisse
Discussion
Offenlegungen
Acknowledgements
Materials
Referenzen
Automatische Übersetzung
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Medizin

Vivo Tayf alanlı optik Koherens tomografi ve lazer Ophthalmoscopy tarama Cx3cr1gfp/gfp muhabir farelerin görüntüleme

Published: November 11, 2017
doi:
10.3791/55984
, , ,
1Department of Ophthalmology and Department of Clinical Research,Bern University Hospital and University of Bern

Summary

Bu protokolü nasıl yüksek çözünürlüklü spektral etki alanı optik Koherens tomografi gibi görüntüleme teknikleri açıklar ve lazer ophthalmoscopy tarama bir oftalmik görüntüleme platformu üzerinde bilgi edinme sistemiyle küçük Rodents yararlı olabilir dağıtım, hücre sırasıyla retina kalınlığı ve mikroglial.

Abstract

Spektral etki alanı optik Koherens tomografi (SD-Ekim) ve tarama lazer ophthalmoscopy (SLO), deneysel Oftalmoloji yaygın olarak kullanılır. Mevcut protokolünde ifade fareler yeşil flüoresan protein (gfp) Cx3cr1 organizatörü altında (BALB/c-Cx3cr1gfp/gfp) microglia hücreleri vivo retina görüntü için kullanıldı. Microglia retina ikamet makrofajlar vardır ve birkaç retina hastalıkları1,2,3,4,5,6‘ karıştığı olmuştur. Bu iletişim kuralı retina B-bir oftalmik görüntüleme platformu sistemi kullanarak inceden inceye gözden geçirmek, SD-Ekim ve microglia hücre dağıtım SLO vivo içindeile Cx3cr1gfp/gfp farelerde görüntüleme ile üretimi için detaylı bir yaklaşım sağlar. İletişim kuralı birkaç muhabir fare satırlarında kullanılabilir. Ancak, burada sunulan protokolü için bazı sınırlamalar vardır. İlk olarak, SLO hem SD-Ekim, yüksek çözünürlüklü modunda kullanıldığında yüksek Aksiyel çözünürlük ama yanal çözünürlük ile veri toplama düşüktür (3,5 µm ve 6 µm, sırasıyla). Ayrıca, SLO odak ve doygunluk düzeyinde son derece parametre seçimi ve doğru hizalama göz bağlıdır. Ayrıca, insan hasta farelerde yüksek toplam optik güç fare göz nedeniyle zorlu için tasarlanan aygıt kullanarak insan gözünün karşılaştırıldığında; Bu büyütme yanlışlıklar7, lateral hangi da büyütme diğerleri arasında fare objektif tarafından bağlı yol açabilir. Ancak, eksenel tarama pozisyon karşın yanal büyütme bağlıdır, eksenel SD-Ekim ölçümleri doğru8.

Introduction

Deneysel Oftalmoloji retina patoloji incelenmesi genellikle histolojik teknikler kullanılarak değerlendirilir. Ancak, Histoloji hayvan euthanization gerektirir ve değişiklik doku güncel özellikler için neden olabilir. SD-Ekim ve SLO rutin klinik Oftalmoloji tanı amaçlı ve diyabetik makula ödemi9, anterior iskemik optik nöropati10veya retinitis pigmentosa11 gibi birkaç retina hastalıkları izleme kullanılır . SD-Ekim ve SLO daha fazla müdahale olmadan dilate pupil aracılığıyla görüntülenmiştir retina, yüksek çözünürlüklü görüntüler oluşturmak non-invaziv teknikler vardır. SD-Ekim SLO retina stereoskopik yüksek kontrastlı görüntüler üretmek için Floresans veri toplarken retina, kesitsel görüntüler oluşturmak için gelmekte veri toplayarak retina yapısı ve retina kalınlık bilgi sağlar. Günümüzde, her iki tekniğin de giderek daha küçük kemirgen12,13,14,15 (ya da bile Zebra balığı16,17) kullanarak deneysel Oftalmoloji kullanılır ve olabilir hem nitel ve nicel bilgi12,17,18,19,20,21sağlar.

Lipofuscins gibi endojen fluorophores birikimi ya da retina drusen oluşumu bu SLO tarafından auto floresan sinyali olarak görüntülenmeyecektir. Bu özellik, tanı ve yaşa bağlı makula dejenerasyonu veya retinitis pigmentosa22,23gibi retina hastalıkları izleme için değerli bir tekniği SLO yapar. Deneysel Oftalmoloji içinde görüntüleme (AF) otomatik Floresans belirli hücre tipleri muhabir fare satırlarındaki tespiti için kullanılabilir. Örneğin, fare heterozigoz gfp Cx3cr124 organizatörü altında bir ifade için in vivo görselleştirme mikroglial hücrelerinin normal retina ve microglia/makrofaj incelenmesi için avantajlı olan Dynamics retina hastalığı21. Microglia doku homeostazı ve doku onarımı yaralanma1,25,26üzerine çok önemli bir rol oynamak retina, ikamet makrofajlar vardır. Microglia harekete geçirmek içinde retina retina yaralanma, iskemi ve dejenerasyonu retina hastalığı2,3,4,5, bu hücrelerinde bir rolü düşündüren, bildirilmiştir 6.

Amacı mevcut protokolü, retina görüntüleme ve SD-Ekim kullanarak ve retina kalınlık ölçüm yapılmasına ve görselleştirme Cx3cr1gfp/gfp fare retina kullanarak gfp olumlu microglia hücreler için nispeten basit bir yöntem tarif etmektir SLO (Heidelberg Spectralis HRA + OCT sistemi). Bu iletişim kuralı çeşitli fare satırlarındaki sağlıklı ya da hasta retina görüntüleme ve kalınlığı ölçümleri için yararlı olabilir. Ayrıca, xarakteristikaları analizleri tanıma ve miktar microglia sayı ve microglia harekete geçirmek SLO21kullanarak retina içinde gerçekleştirilir. Merkezi sinir sistemi (MSS), dejeneratif hastalıklar ve retina27,28,29dahil ile ilişkili Microglia hücrelerdir. Böylece, mevcut protokolünde kullanılan iki yöntem birleştirerek, microglia dağıtım ve retina dejenerasyonu yapılabilir, hangi izleme hastalık şiddeti kolaylaştırabilir veya tedavi edici etkinliği içinde vivoyaklaşıyor.

Protocol

tüm yordamlarda kullanılan 24 kim gfp Cx3cr1 organizatörü altında hızlı BALB/c yetişkin erkek ve dişi fareler vardı. Fareler ARVO açıklamaya göre Ophthalmic ve vizyon araştırma hayvanlar kullanımı için tedavi edildi ve tüm yordamları hayvan refah İsviçre Federal düzenlemelerini göre İsviçre hükümetinin kabul edildi. Fareler medetomidine hidroklorid (0.75 mg/kg) ve ketamin (45 mg/kg) subkutan enjeksiyon tarafından anestezi. Uygun anestezi olduğunu doğrulad?…

Representative Results

Burada sunulan iletişim kuralını kullanarak, SD-Ekim tarar ve SLO görüntüleri Cx3cr1gfp/gfp fareler aynı görüntüleme oturumunda elde edilmiştir. Şekil 3 temsilcisi SD-Ekim 30 ° veya bir 55 ° lens (şekil 3A) ve temsilcisi SLO görüntüleri ile elde edilen tek inceden inceye gözden geçirmek nerede gfp olumlu microglia hücreleri görselleştirildiği 55 ° veya bir 102 ° lens ile elde içerir…

Discussion

Mevcut madde retina B-inceden inceye gözden geçirmek toplama ve görüntüleme gfp olumlu microglia dağıtım fare retina görüntüleme aynı oturumda bir iletişim kuralı gösterir. SD-Ekim ve SLO giderek retina hastalığı hayvan modellerinde saat10,14,17,18,21üzerinde retina değişikliklerini bilgi sağlamak için kullanılır. Bu iletişim kuralı,…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu eser İsviçre Ulusal Bilim Vakfı (SNSF; #320030_156019) bir grant tarafından desteklenmiştir. Yazarlar Heidelberg Engineering GmBH, Almanya kelimelerinde destek aldı.

Materials

Spectralis Imaging system (HRA+OCT) Heidelberg Engineering, Germany N/A ophthalmic imaging platform system
Heidelberg Eye Explorer Heidelberg Engineering, Germany N/A Version 1.9.13.0
78D standard ophthalmic non-contact slit lamp lens Volk Optical Inc., Ohio, USA V78C
Spectralis wide angle 55° lens Heidelberg Engineering, Germany 50897-002
ultra widefield 102° lens Heidelberg Engineering, Germany 50117-001
medetomidine hydrochloride 1 mg/mL (Domitor) Provet AG, Lyssach, Switzerland Swissmedic Nr. 50'590 – ATCvet: QN05CM91 anesthetic/analgesic
ketamine 50mg/ml (Ketalar) Parke-Davis, Zurich, Switzerland 72276388 anesthetic
tropicamide 0.5% + phenylephrine HCl 2.5% (Augentropfen mix) ISPI, Bern, Switzerland N/A pupil dilation
Omnican Insulin-50 0.5 ml G30 0.3 x 12mm B. Braun Mesungen AG, Carl-Braun-Straße, Germany 9151125
hydroxypropylmethylcellulose (Methocel 2%) OmniVision, Neuhausen, Switzerland N/A
+4 dpt rigid gas permeable contact lens Quantum I, Bausch + Lomb Inc., Rochester, NY N/A Base Curve: 7.20 to 8.40 mm
Diameter: 9.00 / 9.60 / 10.20 mm
Power: -25.00 to +25.00 Diopters
balanced salt solution (BSS) Inselspital, Bern, Switzerland N/A
silicon forceps N/A N/A
atipamezole 5 mg/mL (Antisedan) Provet AG, Lyssach, Switzerland N/A α2 adrenergic receptor antagonist
GraphPad Prism 7 GraphPad Software, Inc, San Diego, CA, USA N/A statistical analysis software
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referenzen

  1. Madeira, M. H., Boia, R., Santos, P. F., Ambrosio, A. F., Santiago, A. R. Contribution of microglia-mediated neuroinflammation to retinal degenerative diseases. Mediators Inflamm. , 673090 (2015).
  2. Ng, T. F., Streilein, J. W. Light-induced migration of retinal microglia into the subretinal space. Invest Ophthalmol Vis Sci. 42 (13), 3301-3310 (2001).
  3. Langmann, T. Microglia activation in retinal degeneration. J Leukoc Biol. 81 (6), 1345-1351 (2007).
  4. Joly, S., et al. Cooperative phagocytes: resident microglia and bone marrow immigrants remove dead photoreceptors in retinal lesions. Am J Pathol. 174 (6), 2310-2323 (2009).
  5. Arroba, A. I., Alvarez-Lindo, N., van Rooijen, N., de la Rosa, E. J. Microglia-mediated IGF-I neuroprotection in the rd10 mouse model of retinitis pigmentosa. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (12), 9124-9130 (2011).
  6. Zhang, C., Lam, T. T., Tso, M. O. Heterogeneous populations of microglia/macrophages in the retina and their activation after retinal ischemia and reperfusion injury. Exp Eye Res. 81 (6), 700-709 (2005).
  7. Geng, Y., et al. Optical properties of the mouse eye. Biomed Opt Express. 2 (4), 717-738 (2011).
  8. Lozano, D. C., Twa, M. D. Development of a rat schematic eye from in vivo biometry and the correction of lateral magnification in SD-OCT imaging. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (9), 6446-6455 (2013).
  9. Vaz-Pereira, S., et al. Optical Coherence Tomography Features Of Active And Inactive Retinal Neovascularization In Proliferative Diabetic Retinopathy. Retina. 36 (6), 1132-1142 (2016).
  10. Kokona, D., Haner, N. U., Ebneter, A., Zinkernagel, M. S. Imaging of macrophage dynamics with optical coherence tomography in anterior ischemic optic neuropathy. Exp Eye Res. , (2016).
  11. Makiyama, Y., et al. Macular cone abnormalities in retinitis pigmentosa with preserved central vision using adaptive optics scanning laser ophthalmoscopy. PLoS One. 8 (11), e79447 (2013).
  12. Paques, M., et al. High resolution fundus imaging by confocal scanning laser ophthalmoscopy in the mouse. Vision Res. 46 (8-9), 1336-1345 (2006).
  13. Joshi, R., et al. Spontaneously occurring fundus findings observed using confocal scanning laser ophthalmoscopy in wild type Sprague Dawley rats. Regul Toxicol Pharmacol. 77, 160-166 (2016).
  14. Muraoka, Y., et al. Real-time imaging of rabbit retina with retinal degeneration by using spectral-domain optical coherence tomography. PLoS One. 7 (4), e36135 (2012).
  15. Fischer, M. D., et al. Noninvasive, in vivo assessment of mouse retinal structure using optical coherence tomography. PLoS One. 4 (10), e7507 (2009).
  16. Bell, B. A., et al. Retinal vasculature of adult zebrafish: in vivo imaging using confocal scanning laser ophthalmoscopy. Exp Eye Res. 129, 107-118 (2014).
  17. Bailey, T. J., Davis, D. H., Vance, J. E., Hyde, D. R. Spectral-domain optical coherence tomography as a noninvasive method to assess damaged and regenerating adult zebrafish retinas. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53 (6), 3126-3138 (2012).
  18. Huber, G., et al. Spectral domain optical coherence tomography in mouse models of retinal degeneration. Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (12), 5888-5895 (2009).
  19. Dysli, C., Enzmann, V., Sznitman, R., Zinkernagel, M. S. Quantitative Analysis of Mouse Retinal Layers Using Automated Segmentation of Spectral Domain Optical Coherence Tomography Images. Transl Vis Sci Technol. 4 (4), 9 (2015).
  20. Sim, D. A., et al. A simple method for in vivo labelling of infiltrating leukocytes in the mouse retina using indocyanine green dye. Dis Model Mech. 8 (11), 1479-1487 (2015).
  21. Bosco, A., Romero, C. O., Ambati, B. K., Vetter, M. L. In vivo dynamics of retinal microglial activation during neurodegeneration: confocal ophthalmoscopic imaging and cell morphometry in mouse glaucoma. J Vis Exp. (99), e52731 (2015).
  22. Acton, J. H., Cubbidge, R. P., King, H., Galsworthy, P., Gibson, J. M. Drusen detection in retro-mode imaging by a scanning laser ophthalmoscope. Acta Ophthalmol. 89 (5), e404-e411 (2011).
  23. Greenstein, V. C., et al. Structural and functional changes associated with normal and abnormal fundus autofluorescence in patients with retinitis pigmentosa. Retina. 32 (2), 349-357 (2012).
  24. Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Mol Cell Biol. 20 (11), 4106-4114 (2000).
  25. Wang, X., et al. Requirement for Microglia for the Maintenance of Synaptic Function and Integrity in the Mature Retina. J Neurosci. 36 (9), 2827-2842 (2016).
  26. Ebneter, A., Casson, R. J., Wood, J. P., Chidlow, G. Microglial activation in the visual pathway in experimental glaucoma: spatiotemporal characterization and correlation with axonal injury. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (12), 6448-6460 (2010).
  27. Ebneter, A., Kokona, D., Schneider, N., Zinkernagel, M. S. Microglia Activation and Recruitment of Circulating Macrophages During Ischemic Experimental Branch Retinal Vein Occlusion. Invest Ophthalmol Vis Sci. 58 (2), 944-953 (2017).
  28. Lin, Y. L., Potter-Baker, K. A. Using theoretical models from adult stroke recovery to improve use of non-invasive brain stimulation for children with congenital hemiparesis. J Neurophysiol. , (2017).
  29. Combadiere, C., et al. CX3CR1-dependent subretinal microglia cell accumulation is associated with cardinal features of age-related macular degeneration. J Clin Invest. 117 (10), 2920-2928 (2007).
  30. Bermudez, M. A., et al. Time course of cold cataract development in anesthetized mice. Curr Eye Res. 36 (3), 278-284 (2011).
  31. Toth, C. A., et al. A comparison of retinal morphology viewed by optical coherence tomography and by light microscopy. Arch Ophthalmol. 115 (11), 1425-1428 (1997).
  32. Ebneter, A., Kokona, D., Jovanovic, J., Zinkernagel, M. S. Dramatic Effect of Oral CSF-1R Kinase Inhibitor on Retinal Microglia Revealed by In Vivo Scanning Laser Ophthalmoscopy. Transl Vis Sci Technol. 6 (2), 10 (2017).
  33. Gabriele, M. L., et al. Reproducibility of spectral-domain optical coherence tomography total retinal thickness measurements in mice. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (12), 6519-6523 (2010).
  34. Nakao, S., et al. Wide-field laser ophthalmoscopy for mice: a novel evaluation system for retinal/choroidal angiogenesis in mice. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (8), 5288-5293 (2013).
  35. Wang, N. K., et al. Origin of fundus hyperautofluorescent spots and their role in retinal degeneration in a mouse model of Goldmann-Favre syndrome. Dis Model Mech. 6 (5), 1113-1122 (2013).
  36. Wang, N. K., et al. Cellular origin of fundus autofluorescence in patients and mice with a defective NR2E3 gene. Br J Ophthalmol. 93 (9), 1234-1240 (2009).
  37. Thanos, S. Sick photoreceptors attract activated microglia from the ganglion cell layer: a model to study the inflammatory cascades in rats with inherited retinal dystrophy. Brain Res. 588 (1), 21-28 (1992).
  38. Hughes, E. H., et al. Generation of activated sialoadhesin-positive microglia during retinal degeneration. Invest Ophthalmol Vis Sci. 44 (5), 2229-2234 (2003).

Tags

Keywords: In Vivo ImagingCx3cr1gfp/gfp Reporter MiceSpectral-domain Optical Coherence TomographyScanning Laser OphthalmoscopyRetinal ThicknessMicroglial Cell DistributionNon-invasiveCorneal Contact LensInfrared ImagingAutofluorescence Imaging
check_url/de/55984?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Diesen Artikel zitieren
Kokona, D., Jovanovic, J., Ebneter, A., Zinkernagel, M. S. In Vivo Imaging of Cx3cr1gfp/gfp Reporter Mice with Spectral-domain Optical Coherence Tomography and Scanning Laser Ophthalmoscopy. J. Vis. Exp. (129), e55984, doi:10.3791/55984 (2017).
Zitat herunterladen
Nachdrucke und Berechtigungen

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image