إينتراسبلينيك زرع خلايا الكبد بعد ظهرت جزئيا في إيماءة. الفئران مشمولان
Summary
لقد قمنا بوصف بروتوكول لأداء ظهرت الجزئي (PHx) وزرع الخلايا عن طريق الطحال في إيماءة. إخضاعها (إيماءة. /J CB17-بركدكمشمولان) الفئران. في هذا البروتوكول، ويتم شق إلى فضح ويرسخ الفص الأيسر من الكبد متبوعاً بشق آخر لزرع الخلايا إينتراسبلينيك.
Abstract
ظهرت الجزئي أسلوب تنوعاً واستنساخه لدراسة تجديد الكبد وتأثير الخلية على أساس المداواة في مختلف الحالات المرضية. ظهرت جزئية يسهل أيضا انجرافتمينت زيادة وانتشار الخلايا المزروعة neovascularization المتسارع والهجرة الخلية نحو الكبد. هنا، يمكننا وصف بروتوكول بسيط لأداء ظهرت 30% وزرع الخلايا في الطحال من غير السمنة السكري/حاد جنبا إلى جنب إيماءة العوز. إخضاعها (إيماءة. /J CB17-بركدكمشمولان) الماوس.
في هذا الإجراء، يتم إجراء شقوق صغيرة اثنين. الشق الأول هو فضح ويرسخ الفص الأيسر من الكبد، ويتم إجراء شق صغير آخر لفضح الطحال لزرع الخلايا إينتراسبلينيك. هذا الإجراء لا يتطلب أي مهارات جراحية متخصصة، وأنها يمكن أن تكتمل في غضون 5-7 دقائق مع أقل الإجهاد والألم والشفاء أسرع وأفضل البقاء على قيد الحياة. لقد أظهرنا زرع خلايا الكبد المعزولة من بروتين فلورية خضراء (بروتينات فلورية خضراء) معربا عن الماوس (المعدلة وراثيا C57BL/6–تيراغرام (UBC-التجارة والنقل) 30Scha/ي)، فضلا عن تتمثل مثل خلايا المنشأ البشرية (نوب) في هيباتيكتوميزيد جزئيا إيماءة. مشمولان الفئران.
Introduction
في الوقت الراهن، يقترح زرع تتمثل كبديل لزرع كامل لعلاج المرضى بعد اضطرابات حادة في الكبد. ويعتقد أنه يمكن سد المرضى للجهاز كله زرع1. بالإضافة إلى خلايا الكبد allogenic2،3 من خلايا الكبد إكسينوجينيك وخلايا الكبد المستمدة من الخلايا الجذعية البالغة4 كما يجري التحقيق في نماذج حيوانية. في هذا السياق، بصاروخ موجه وانجرافتمينت إمكانية زرع خلايا المتلقي معياراً هاما للخلية على أساس العلاج في فشل كبدي حاد (AHF).
للتحقيق في زرع خلايا الكبد أو خلايا تتمثل مثل5، يتم إنشاء أهف في نموذج حيوان أما عن طريق الجراحة6 أو الإجراءات الدوائية7 ، متبوعاً بزرع الخلايا. جعل نموذج حيوان AHF الكواشف الدوائية، والعديد من هيباتوتوكسينس مثل د-جالاكتوساميني8، أسيتامينوفين9،10من رابع كلوريد الكربون، ثيواسيتاميدي11، كونكانافالين A12، lipopolysaccharide13 ، إلخ.، وقد استخدمت. من هذه القائمة، كل كاشف ينشئ مجموعة فريدة من ميزات لأهف، ولكن للأسف لا كاشف واحد يقلد AHF البشرية. وعلاوة على ذلك، AHF الناجمة عن هيباتوتوكسينس وقتاً طويلاً، مما يضع الحيوانات تحت الإجهاد المزمن، وصعوبة الحصول على النتائج استنساخه.
من ناحية أخرى، العملية الجراحية لظهرت الجزئي (PHx) تعتمد المهارة، والنتائج استنساخه من السهل الحصول عليها بعد تطوير المهارات المطلوبة. مطلوب لحمل أهف بالتدخل الجراحي وحدها، بتر أكثر من 70% من الكبد؛ ومع ذلك، أقل من ظهرت 70% لا يزال يمكن أن تستخدم لدراسة انجرافتمينت وانتشار زرع الخلايا في الكبد لتحليل قدراتها العلاجية خلال14من تلف في الكبد. وقد زرع خلايا الكبد ظهرت الوظيفة المؤداة عن طريق الصفاق15، ذيل الوريد16، الوريد الكبدي17أو الطحال18. حقن الوريد الكبدي وزرع خلايا الكبد إينتراسبلينيك حاليا الإجراءات المفضلة، كما أنها أسهل في إعادة إنتاج.
في هذه الورقة، التي وصفناها إجراء لظهرت جزئية في إيماءة 30%. إخضاعها (إيماءة. CB17-Prkdcscid/J) الفئران هي التي اقتطعت الفص الأيسر من الكبد. تبعتها زرع 0.2 مليون بروتينات فلورية خضراء وإذ تعرب عن الماوس (C57BL/6–تيراغرام (UBC-التجارة والنقل) 30Scha/ي) خلايا الكبد، فضلا عن البشرية المنشأ نوب19 في الطحال. ويؤدي هذا الإجراء إلى engraftment الخلايا المزروعة في الكبد. ويتم هذا الإجراء الأقل الغازية وتقنية دنيا مؤلمة.
Protocol
Representative Results
Discussion
ظهرت الجزئي أسلوب المنشأة لتجديد الكبد التحقيق، وذكر ظهرت المفرط لتقليد النموذج أف. بين نماذج حيوانية من أف، من القوارض، خاصة من الفئران، نموذج بحث آخر. للحصول على نموذج إصابة كبد في الفئران، حتى ظهرت 70% سجلت مع25،معدل البقاء على قيد الحياة جيدة26. ومع ذلك عار…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل المنحة الأساسية الواردة من إدارة التكنولوجيا الأحيائية، “حكومة الهند” إلى “المعهد الوطني لعلم المناعة”، نيودلهي. الدكتور بهاتاشارجى العنوان الحالي هو شعبة من أمراض الجهاز الهضمي والكبد والتغذية ومستشفى لوس أنجليس في الأطفال.
Materials
| Gas Anesthesia System | Ugo Basile; Italy | 211000 | |
| Weighing machine | Goldtech ; India | Local Procurement | |
| Biological safety cabinet ( Class I) | Kartos international; India | Local Procurement | |
| Hair Trimmer | Panasonic ; Japan | ER-GY10 | |
| Straight operating scissor with sharp /sharp blades | Major Surgicals; India | Local Procurement | |
| Forceps with Serrations | Major Surgicals; India | Local Procurement | |
| Micro needle holders straight & curved | Mercian ; England | BS-13-8 | |
| 1 ml insulin syringe with 30G *5/16 needles | Dispo Van; India | ||
| 1 ml syringe with 26 G * 1/2 needle | BD ; US | REF 303060 | |
| Nylon Threads | Mighty ; India | (1-0) Local Procurement | |
| MERSUTURES 4-0 Sterilised Surgical Needled Suture | Ethicon, Johnson & Johnson, India | NW 5047 | |
| TRUGUT 76 cm 4-0 absorbable surgical suture | Sutures India Pvt. Ltd; India | SN 5048 | Sterilised Surgical Needled Suture Catgut Chromic |
| Cotton Buds | Pure Swabs Pvt Ltd ; India | Local Procurement | |
| Surgical Tape | 3M India ; India | 1530-1 | Micropore Surgical Tape |
| Microtome | Histo-Line Laboratories, Italy | MRS3500 | |
| Shandon Cryotome E Cryostat | Thermo Electron Corporation ; US | ||
| Confocal laser scanning microscope | Carl Zeiss ; Germany | LSM 510 META | |
| Bright Field Microscope | Olympus, Japan | LX51 | |
| Automated analyser | Tulip, Alto Santracruz, India | Screen Maaster 3000 | Biochemical analyser for liver functional test |
| Flow Cytometer | BD ; US | BD FACSverse | Assesment of presence of cells post transplantation |
| Veet hair removal cream | Reckitt Benckiser , India | ||
| FORANE | Abbott ; US | isoflurane USP 99.9% | |
| Taxim | AlKem ; India | cefotaxime sodium injection | |
| Povidone-Iodine solution | Win-Medicare; India | Betadine | |
| Paraformaldehyde | Himedia; India | GRM 3660 | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Life technologies, Thermo Fisher scientific ; US | 12200-036 | |
| Sucrose | Sigma ; US | S0389 | |
| Tissue-Tek | Sakura; US | 25608-930 | O.C.T compound |
| DAPI | Himedia; India | MB 097 | |
| anti-Albumin goat Polyclonal | Thermo Scientific,Pierce, US | PA126081 | |
| anti-connexin 32/GJB1 Polyclonal | abcam, UK | ab64609-500 | |
| antiGFP rabbit polyclonal | Santa Cruz biotechnology; US | SC 8334 | |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-goat | Molecular Probes , Thermo Fisher Scientific ; US | A11058 | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-sheep | Molecular Probes , Thermo Fisher Scientific ; US | A11015 | |
| Alexa Fluor 594 chicken anti rabbit | Molecular Probes , Thermo Fisher Scientific ; US | A21442 | |
| Goat anti rabbit IgG HRP | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific; US | 65-6120 | |
| anti-Ki67 antibody | abcam, UK | ab15580 | |
| Antigen Unmasking Solution, Citric acid base | Vector laboratories, US | H-3300 | |
| ProLong Diamond antifade mountant | Life technologies, Thermo Fisher scientific ; US | P36966 | |
| SGOT (ASAT) KIT | Coral Clinical System, India | ||
| SGPT (ALAT) KIT | Coral Clinical System, India | ||
| Alkaline Phosphatase Kit (DEA) | Coral Clinical System, India | ||
| Hematoxylin Solution, Mayer's | Sigma ; US | MHS16 | |
| Eosin Y solution, alcoholic | Sigma ; US | HT110132 | |
| DPX Mountant | Sigma ; US | 6522 | |
| Melonex (Pain Killer) | Intas Pharmaceuticals Ltd; India | Meloxicam injection | |
| DAB enhanced liquid substrate system tetrahydrochloride | Sigma ; US | D3939 |
Referenzen
- Nussler, A., et al. Present status and perspectives of cell-based therapies for liver diseases. J. Hepatol. 45 (1), 144-159 (2006).
- Ponder, K. P., et al. Mouse hepatocytes migrate to liver parenchyma and function indefinitely after intrasplenic transplantation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88 (4), 1217-1221 (1991).
- Kokudo, N., Horimoto, H., Ishida, K., Takahashi, S., Nozawa, M. Allogeneic hepatocyte and fetal liver transplantation and xenogeneic hepatocyte transplantation for Nagase’s analbuminemic rats. Cell Transplant. 5 (5 Suppl 1), S21-S22 (1996).
- Christ, B., Bruckner, S., Stock, P. Hepatic transplantation of mesenchymal stem cells in rodent animal models. Methods Mol. Biol. 698, 315-330 (2011).
- Fox, I. J., Roy-Chowdhury, J. Hepatocyte transplantation. J. Hepatol. 40 (6), 878-886 (2004).
- Glanemann, M., et al. Transplantation of monocyte-derived hepatocyte-like cells (NeoHeps) improves survival in a model of acute liver failure. Ann. Surg. 249 (1), 149-154 (2009).
- Rahman, T. M., Hodgson, H. J. Animal models of acute hepatic failure. Int. J. Exp. Pathol. 81 (2), 145-157 (2000).
- Zhang, L., et al. Granulocyte colony-stimulating factor treatment ameliorates liver injury and improves survival in rats with D-galactosamine-induced acute liver failure. Toxicol. Lett. 204 (1), 92-99 (2011).
- Gardner, C. R., et al. Role of nitric oxide in acetaminophen-induced hepatotoxicity in the rat. Hepatology. 27 (3), 748-754 (1998).
- Nardo, B., et al. Successful treatment of CCL4-induced acute liver failure with portal vein arterialization in the rat. Transplant Proc. 38 (4), 1187-1189 (2006).
- Sathyasaikumar, K. V., et al. Fulminant hepatic failure in rats induces oxidative stress differentially in cerebral cortex, cerebellum and pons medulla. Neurochem. Res. 32 (3), 517-524 (2007).
- Wu, J., et al. Laennec protects murine from concanavalin A-induced liver injury through inhibition of inflammatory reactions and hepatocyte apoptosis. Biol. Pharm. Bull. 31 (11), 2040-2044 (2008).
- Kaur, G., Tirkey, N., Chopra, K. Beneficial effect of hesperidin on lipopolysaccharide-induced hepatotoxicity. Toxicology. 226 (2-3), 152-160 (2006).
- Rupertus, K., et al. Major but not minor hepatectomy accelerates engraftment of extrahepatic tumor cells. Clin. Exp. Metastasis. 24 (1), 39-48 (2007).
- Selden, C., Casbard, A., Themis, M., Hodgson, H. J. Characterization of long-term survival of syngeneic hepatocytes in rat peritoneum. Cell Transplant. 12 (6), 569-578 (2003).
- Tang, T. H., et al. The role of donor hepatocytes and/or splenocytes pre-injection in reducing islet xenotransplantation rejection. Hepatobiliary. Pancreat. Dis. Int. 2 (3), 344-350 (2003).
- Goto, Y., Ohashi, K., Utoh, R., Yamamoto, M., Okano, T. Hepatocyte transplantation through the hepatic vein: a new route of cell transplantation to the liver. Cell Transplant. 20 (8), 1259-1270 (2011).
- Gabelein, G., et al. Intrasplenic or subperitoneal hepatocyte transplantation to increase survival after surgically induced hepatic failure?. Eur. Surg. Res. 41 (3), 253-259 (2008).
- Bhattacharjee, J., et al. Autologous NeoHep Derived From Chronic Hepatitis B Virus Patients’ Blood Monocytes by Upregulation of cMET Signaling. Stem Cells Transl. Med. , (2016).
- . . Basic surgical skills. Emergency and Essential Surgical Care (EESC) programme. , (2017).
- Pritchett-Corning, K. R., Luo, Y., Mulder, G. B., White, W. J. Principles of rodent surgery for the new surgeon. J. Vis. Exp. (47), (2011).
- Lee, S. M., Schelcher, C., Demmel, M., Hauner, M., Thasler, W. E. Isolation of human hepatocytes by a two-step collagenase perfusion procedure. J. Vis. Exp. (79), (2013).
- Shen, L., Hillebrand, A., Wang, D. Q., Liu, M. Isolation and primary culture of rat hepatic cells. J. Vis. Exp. (64), (2012).
- Bhattacharjee, J., et al. Autologous NeoHep Derived from Chronic Hepatitis B Virus Patients’ Blood Monocytes by Upregulation of c-MET Signaling. Stem Cells Transl. Med. 6 (1), 174-186 (2017).
- Hori, T., et al. Simple and sure methodology for massive hepatectomy in the mouse. Ann. Gastroenterol. 24 (4), 307-318 (2011).
- Hori, T., et al. Simple and reproducible hepatectomy in the mouse using the clip technique. World J. Gastroenterol. 18 (22), 2767-2774 (2012).
- Vidal, I., Richert, L. The nude mouse as model for liver deficiency study and treatment xenotransplantation. Int. J. Hepatol. , 1400147 (2012).
- Mitchell, C., Willenbring, H. A reproducible and well-tolerated method for 2/3 partial hepatectomy in mice. Nat. Protoc. 3 (7), 1167-1170 (2008).
- Ahmed, S. U., et al. Generation of subcutaneous and intrahepatic human hepatocellular carcinoma xenografts in immunodeficient mice. J. Vis. Exp. (79), e50544 (2013).
- Krikri, A., et al. Laparoscopic vs. open abdominal surgery in male pigs: marked differences in cortisol and catecholamine response depending on the size of surgical incision. Hormones (Athens). 12 (2), 283-291 (2013).
