Primordiale geslachtscellen transplantatie voor CRISPR/Cas9 gebaseerde sprongen in Xenopus

Summary

Genen essentieel voor overleving vormen technische hindernissen voor het maken van mutant lijnen. Sprongen omzeilt letaliteit door het combineren van genoom bewerken met primordiale geslachtscellen transplantatie wild-type dieren uitvoering germline mutaties maken. Sprongen maakt ook de efficiënte generatie homozygoot null mutanten in de F₁ generatie. Hier, wordt de transplantatie stap aangetoond.

Abstract

De oprichting van mutant lijnen door het bewerken van het genoom versnelt genetische analyse in vele organismen. CRISPR/Cas9 methoden zijn aangepast voor gebruik in de Afrikaanse klauwkikker kikker, Xenopus, een langdurige modelorganisme voor biomedisch onderzoek. Traditionele fokken regelingen voor het maken van homozygoot mutant lijnen met CRISPR/Cas9-gerichte mutagenese hebben verschillende tijdrovend en moeizaam stappen. Ter vergemakkelijking van de oprichting van mutant embryo’s, met name voor het overwinnen van de obstakels die is gekoppeld aan het uitsparen van genen die essentieel voor embryogenese zijn, ontstond een nieuwe methode genaamd sprongen. Deze techniek maakt gebruik van de robuustheid van Xenopus embryo’s “knippen en plakken” embryologische methoden. Sprongen maakt gebruik van de overdracht van primordiaal kiemcellen (PGCs) van efficiënt mutagenized donor embryo’s in wildtype PGC-ablated worden broers en zussen. Deze methode zorgt voor de efficiënte mutatie van essentiële genen door het creëren van chimeer dieren met wildtype somatische cellen die een mutant germline dragen. Wanneer twee F₀ dieren uitvoering “haasje transplantaties” (dat wil zeggen, mutant geslachtscellen) zijn intercrossed, ze produceren homozygoot of samengestelde heterozygote, null F₁ embryo’s, waardoor het opslaan van een volledige generatietijd om fenotypische gegevens te verkrijgen. Sprongen biedt ook een nieuwe aanpak voor het analyseren van maternale effect genen, die vuurvaste F₀ fenotypische analyse na CRISPR/Cas9 mutagenese. Dit manuscript detailleert de methode van de sprongen, met speciale nadruk op het succesvol uitvoeren van PGC transplantatie.

Introduction

Hoe genotype codeert fenotype is een grote vraag in de biologie sinds de herontdekking van wetten van Mendel. Inzicht in de rollen van genen, hun regelgeving en interacties binnen gene netwerken, en de functies van gecodeerde producten belooft te bieden hulpprogramma’s voor het blootleggen nieuwe biologie en verbetering van ziekte staten. Voor meer dan de helft een eeuw¹is de Afrikaanse klauwkikker kikker, Xenopus, een toonaangevende model voor studies over een breed scala aan onderwerpen in de fundamentele biologie en de biogeneeskunde, met inbegrip van de genetische controle van ontwikkeling. Historisch, meeste onderzoek op Xenopus hanteert de allotetraploid kikker, X. laevis, maar meer recentelijk als gevolg van de diploidy, X. tropicalis is ontwikkeld als een amfibie genetische model. Compleet genoom sequenties zijn samengesteld uit beide Xenopus soorten^2,3. De “kikker Gemeenschap” is nu op een keerpunt waar fundamentele genoom modificatietechnologie toelaat de studie van de genfunctie, vrijwel op wil. Programmeerbare CRISPR/Cas9 enzym hebben de mutagenese van genen zeer efficiënt, met biallelic mutatie mogelijk in de meeste cellen van de dierlijke^{4,5,6,7, 8,9,10,11}. Deze studies, onderstreept door Bhattacharya et al. ¹² en Shigeta et al. ¹³, hebben aangetoond dat de functie van veel genen door mutagenese in F₀ mozaïek dieren kan worden bestudeerd. Deze aanpak heeft vele voordelen; embryo’s Cas9-sgRNA-microinjected wordt echter vaak een variabele fenotypen als gevolg van onvolledige verlies van functie (LOF) weergegeven. En wat nog belangrijker is, de generatie van mutant lijnen is zeer voordelig voor sommige toepassingen — in het bijzonder bij de studie van genen die een maternale mRNA-bijdrage hebben. Maternale mRNAs en proteïnen, en hun invloeden op de epigenetica, aanhouden gedurende een langere periode in embryogenese^14,15,16, waardoor de vroege ontwikkeling bijdragen van vele genen vuurvaste tot F₀ analyses. Andere benaderingen LOF zijn dus vereist.

Bij het zoeken naar mutant lijnen te maken, heeft het pad naar het verkrijgen van de embryo’s homozygoot LOF verschillende obstakels. Eerste, efficiënte mutagenese voor de productie van biallelic mutaties kunnen nadelig zijn, omdat het verlies van essentiële gene functies resulteert in falen om te overleven naar seksuele volwassenheid, mengend in de productie van een levensvatbare lijn. Een gemeenschappelijke oplossing is de zorgvuldige titratie van het bedrag van Cas9-sgRNA geleverd. Hier, is het doel om een evenwicht tussen de vermindering van de letaliteit terwijl ook maximaliseren van de efficiëntie van germline mutagenese. Een tweede probleem vloeit voort uit de standaard fokken regeling, waar fenotypische analyses zijn uitgesteld tot de F₂ generatie. Met behulp van de standaardbenadering, seksueel volwassen F₀ dieren die mutant allelen via de germline zijn outcrossed zenden voor de productie van F₁ heterozygoot “vervoerders”, die zijn vervolgens uitgegroeid tot seksuele volwassenheid. Twee F₁ heterozygoten zijn dan intercrossed om te produceren van F₂ mutant embryo’s bij een verwachte Mendelian frequentie van 25%. Twee generaties van de fok zijn dus nodig voor de analyse van de mutant fenotypen. Mutant dieren kunnen zijn homozygotes of samengestelde heterozygoten (dat wil zeggen, nakomelingen met twee verschillende allelen voor mutant, die afhangt van de genotypen van de ouderlijke proefdieren in de F-₁ -intercross).

Deze obstakels kunnen worden weggenomen door het beperken van programmeerbare nuclease-gemedieerde mutagenese naar germinale cellen, die de basis vormt van een nieuwe methode genaamd sprongsgewijze¹⁷. Sprongen bestaat uit twee hoofdonderdelen: (1) de microinjection van de Cas mRNA samen met sgRNA, of nuclease-sgRNA complexen (of, in beginsel, TALENs of zink vinger nucleasen) stadium de eencellige efficiënt mutagenize embryonaal genoom, gevolgd door (2) de transplantatie van PGCs in wildtype broer/zus embryo’s, waar de endogene PGCs werden verwijderd. Wanneer beide stappen zijn efficiënte, volledige germline vervanging en de mutant geslachtscellen kunnen worden verkregen. Blackler aangetoond in de vroege jaren 1960 dat Xenopus PGCs kon worden getransplanteerd tussen embryo’s op de late neurula en vroege tailbud fasen^18,19. Voor sprongen, werd Blackler de aanpak gewijzigd door het uitvoeren van de transplantatiecentra op de blastocyste stadium¹⁷, wanneer PGCs zijn gelokaliseerd in de vegetal pool van het embryo^20,21. Transplantatie voordat gastrulatie twee belangrijke voordelen heeft. Ten eerste is de engraftment van transplantaties en de verdere ontwikkeling van de normale bleek te zijn efficiënter wanneer de transplantatie wordt uitgevoerd in het stadium van de blastocyste (niet-gepubliceerde opmerkingen). Ten tweede, door blastocyste-fase transplantaties te voeren kort nadat zygotic transcriptie is begonnen, kan men de letaliteit als gevolg van ontwikkelingsstoornissen gen mutaties die gastrulatie of die verstoren anderszins tot misvormde laat neurulae leiden vermijden. PGC transplantatie-bevattende (“overgeslagen”) embryo’s worden geteeld naar seksuele volwassenheid, en intercrosses tussen deze F₀ dieren hebben aangetoond dat, in veel gevallen, 100% van het nageslacht van F₁ het fenotype van de LOF (meeste zijnde samengestelde weergeven heterozygoten), met vermelding van de volledige germline vervanging door de gerichte mutaties.

De verwachting is dat de sprongen genetische benaderingen in Xenopuszal versnellen. Sprongen biedt ook een alternatief voor de “overdracht van de ontvangst” methode²² voor de analyse van de LOF van moeders-effect genen (niet-gepubliceerde opmerkingen). In de huidige publicatie, wordt een gedetailleerde beschrijving van de methode, vooral gericht op PGC transplantatie, voorgesteld in X. tropicalis (met kleine wijzigingen voor X. laevis). De transplantatie van PGCs is hier gedemonstreerd om een snellere overdracht van deze technologie aan andere laboratoria die werken met Xenopus. De beginselen van deze methode moeten lukken in andere amfibieën (bijvoorbeeld urodeles) en organisme-specifieke wijzigingen in de methodologie ruimte laten voor toepassing op vele andere dieren waarin efficiënte mutagenese kan worden bereikt en PGCs zijn gemakkelijk transplanteerbaar.

Protocol

Alle methoden die hier worden beschreven zijn goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik van het Comité van de Universiteit van Californië, Irvine. 1. voorbereiding voor PGC transplantatie Bereiden dissectie hulpmiddelen, als eerder beschreven23.Opmerking: Wenkbrauw haren messen worden gebruikt voor het maken van insnijdingen met de hulp van een haar lus te stabiliseren van het embryo tijdens het uitvoeren van de operaties. Wenkbrauw haren…

Representative Results

Na transplantatie, de kwalitatieve bepaling van de efficiëntie van CRISPR/Cas9 mutagenese moet worden uitgevoerd voordat de inspanning in de veehouderij te groeien en te handhaven van de dieren naar seksuele volwassenheid gebruikten. Omdat dieren uitvoering leapfrog transplantaties somatically wildtype zijn en de germline is moeilijk toegankelijk voor directe metingen, wordt opslaan van de karkassen van donor embryo’s belangrijker. DNA-analyse van de kadavers dient als een maatstaf voor …

Discussion

Dit rapport bevat een gedetailleerd protocol voor de transplantatie van plantaardig weefsel bevattende PGCs. transplantatie van PGCs wordt gebruikt in combinatie met bewerken van genoom technologieën (b.v., CRISPR/Cas9) te wijzigen van de kiemcellen van een dier terwijl behoud van bijna alle van de somatische weefsels als genetisch wild type. Voor sprongen om succesvol te zijn, zijn er een aantal kritische factoren om te overwegen voordat presterende transplantaties wordt uitgevoerd.

<p class="jove_content"…

Materials

Dumont #5 forceps	Fine Science Tools	11252-20 or 11252-30
Eyebrow hair knife			Homemade
Hair loop			Homemade
Pasteur pipettes, borosilicate glass	Fisher Scientific	13-678-20A
Krazy Glue (Cyanoacrylate-based)	Elmer's Products, Inc.	KG581	To affix eyebrow hair and hair loops into Pasteur pipettes, other similar glues can be used.
Oligodeoxynucleotides, custom ordered	Integrated DNA Technologies	Custom ordered	Template oligos for sgRNA synthesis, see Nakayama et al., 2014 for design details.
Megascript T7 kit	Ambion/ThermoFisher	AM1334	Or use Megashortscript T7 (AM1354) kit
Phenol, Tris buffered			High quality distilled phenol from any commercial supplier
Chloroform			High quality chloroform from any commercial supplier
Ethanol			High quality ethanol from any commercial supplier
Diethylpyrocarbonate (DEPC)	Sigma Chemical Co.	D5758-50ML
Cas9 protein, with nuclear localization signal	PNA Bio, Inc.	CP01	Reconstituted using DEPC-treated water according to manufacturer's recommendations
10X Marc's Modified Ringers solution			Homemade. Recipe (ref 26) for 1X MMR (lacking EDTA) is 100mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 5 mM HEPES. Solution is pH adjusted to 7.4.
Agarose			Any Molecular Biology grade agarose is sufficient
60 X15 mm Petri plates	Falcon	351007
24-well plates	Falcon	3047
L-Cysteine	Sigma Chemical Co.	C7352-100G	Free base, not HCl salt
Proteinase K	Roche	03 115 828 001	Typically ~20mg/ml from Roche
sera Micron	sera		Tadpole food. Resuspend in growth medium. Can be purchased from a variety of online retailers