Keim Urzelle Transplantation für CRISPR/Cas9-basierte in Xenopus überspringen
Summary
Gene überlebensnotwendig stellen technische Hürden für die Erstellung von mutierter Linien. Leap Frogging umgeht Letalität durch die Kombination von Genom-Bearbeitung mit Keim Urzelle Transplantation Wildtyp Tiere Keimbahn-Mutationen zu erstellen. Leap Frogging erlaubt auch die effiziente Erzeugung von homozygot null Mutanten in der F-1 -Generation. Hier wird die Transplantation Schritt demonstriert.
Abstract
Die Schaffung von mutierten Linien von Genom-Bearbeitung beschleunigt genetische Analyse in vielen Organismen. CRISPR/Cas9 Methoden wurden für den Einsatz in der afrikanischen krallenbewehrten Frosch, Xenopus, langjährige Modellorganismus für die biomedizinische Forschung angepasst. Klassische Züchtung Regelungen für die Erstellung von homozygoter Mutante Linien mit CRISPR/Cas9-gezielte Mutagenese haben mehrere zeitaufwändige und mühsame Schritte. Zur Erleichterung der Schaffung von mutierten Embryonen, besonders um die Hindernisse, die Gene, die für die Embryogenese, ausschlagen zugeordnet wurde eine neue Methode namens Leap Frogging entwickelt. Diese Technik nutzt die Robustheit des Xenopus Embryonen “Ausschneiden und einfügen” embryologischen Methoden. Leap Frogging nutzt die Übertragung der primordialen Keimzellen (PGCs) aus effizient mutagenisierter Spender Embryonen in PGC abgetragen Wildtyp Geschwister. Diese Methode ermöglicht die effiziente Mutation des wesentlichen Gene durch die Schaffung von Chimären Tiere mit Wildtyp-Körperzellen, die ein mutiertes Keimbahn tragen. Wenn zwei F0 Tiere tragen “leapfrog Transplantationen” (d. h. mutierten Keimzellen) sind intercrossed, sie produzieren homozygote oder compound heterozygote, null F1 Embryonen, spart eine ganze Generationszeit, phänotypische Daten zu erhalten. Leap Frogging bietet auch einen neuen Ansatz für die Analyse von mütterlicher Effekt Gene, die refraktär gegenüber F0 phänotypische Analyse nach CRISPR/Cas9 Mutagenese sind. Dieses Manuskript beschreibt die Methode der Leap Frogging, mit besonderem Schwerpunkt auf PGC Transplantation erfolgreich durchführen.
Introduction
Wie Genotyp Phänotyp kodiert wurde eine wichtige Frage in der Biologie seit der Wiederentdeckung der Mendelschen Regeln. Ein Verständnis für die Rolle der Gene, deren Regulation und Interaktionen innerhalb von Gen-Netzwerken und die Funktionen der codierte Produkte versprechen die Werkzeuge für Aufdeckung neue Biologie und bessernde Krankheitszustände. Mehr als die Hälfte ein Jahrhundert1seit der afrikanischen krallenbewehrten Frosch, Xenopus, eine führende Modell für Studien zu den unterschiedlichsten Themen in grundlegende Biologie und Biomedizin, einschließlich die genetische Kontrolle der Entwicklung. Historisch hat die meiste Forschung auf Xenopus Allotetraploid Frosch, laevis, verwendet aber in jüngerer Zeit, aufgrund seiner Diploidie X. tropicalis wurde entwickelt als Amphibien genetisches Modell. Vollständige Genomsequenzen sind von beiden Xenopus Arten2,3zusammengestellt. Die “Frog-Community” ist jetzt an einem Wendepunkt angelangt wo ermöglicht grundlegende Genom Änderung Technologie das Studium der Genfunktion, praktisch nach Belieben. Programmierbare CRISPR/Cas9 jedoch haben die Mutagenese von Genen hocheffizient mit biallelische Mutationen möglich in den meisten Zellen der Tier4,5,6,7gemacht, 8,9,10,11. Diese Studien, untermalt von Bhattacharya Et al. 12 und Shigeta Et al. 13, haben gezeigt, dass die Funktion vieler Gene durch Mutagenese in F0 Mosaik Tiere untersucht werden kann. Dieser Ansatz hat viele Vorteile; Cas9-SgRNA-mikroinjiziert Embryonen werden jedoch oft Variable Phänotypen aufgrund unvollständiger Funktionsverlust (LOF) angezeigt. Noch bedeutsamer ist, die Generation der mutierten Linien ist ein großer Vorteil für einige Anwendungen – insbesondere bei der Gene, die einen mütterliche mRNA-Beitrag zu studieren. Mütterliche mRNAs und Proteine und ihre Einflüsse auf die Epigenetik, bleiben über einen längeren Zeitraum in Embryogenese14,15,16, Darstellung der frühen Entwicklungsstörungen Beiträge vieler Gene feuerfeste F0 Analysen. Daher sind andere LOF Ansätze erforderlich.
Bei der Suche nach mutierten Linien zu erstellen, muss der Pfad auf die Erlangung von homozygot LOF Embryonen mehrere Hindernisse. Erste, effiziente Mutagenese biallelische Mutationen produzieren kann nachteilig sein, weil Verlust von wesentlichen Genfunktionen scheitern, Geschlechtsreife, stören die Herstellung einer tragfähigen Linie überleben führt. Eine gemeinsame Lösung ist die sorgfältige Titration der Höhe der Cas9-SgRNA geliefert. Hier ist das Ziel, ein Gleichgewicht zwischen reduziert Letalität bei gleichzeitiger Maximierung der Keimbahn Mutagenese Effizienz auch. Ein zweites Problem ergibt sich aus der standard Zucht-Schema, wo phänotypische Analysen bis F-2 -Generation aufgeschoben. Mit dem standard-Ansatz, sexuell Reifen Sie F0 Tiere, die Mutante zu übertragen, die Allele durch die Keimbahn outcrossed sind zur Herstellung F1 heterozygote “Träger”, die dann zur Geschlechtsreife angebaut werden. Zwei F-1 -heterozygot sind dann intercrossed, um F2 mutierten Embryonen mit einer erwarteten Mendelian Frequenz von 25 % zu produzieren. So sind zwei Generationen der Zucht notwendig für die Analyse der Mutanten Phänotypen. Mutierte Tiere könnte entweder homozygoten oder compound-heterozygot (d. h. nachkommen, enthält zwei verschiedene mutierten Allele, die abhängig von der Genotypen der Elterntiere in der F1 Intercross verwendet).
Diese Hindernisse können überwunden werden, durch die Beschränkung programmierbare Nuklease-vermittelten Mutagenese, Keimzellen, die eine neue Methode namens sprunghaften17zugrunde liegt. Leap Frogging besteht aus zwei Hauptkomponenten: (1) die Mikroinjektion von Cas-mRNA zusammen mit SgRNA oder Nuklease-SgRNA-komplexe (oder, im Prinzip, TALENs oder Zink-Finger-Nukleasen) Zeitpunkt der einzelligen effizient embryonale Genom mutagenize, gefolgt von (2) die Transplantation von PGCs auf Wildtyp Geschwister Embryonen, wo die endogenen PGCs entfernt wurden. Wenn beide Schritte sind effiziente und vollständige Keimbahn-Ersatz mit mutierten Keimzellen erhalten. Blackler bewiesen in den frühen 1960er Jahren, dass Xenopus PGCs zwischen den Embryonen im späten Neurula und frühen Tailbud Stufen18,19transplantiert werden konnte. Für Leap Frogging, wurde Blacklers Ansatz modifiziert durch Ausführen der Transplantationen im Blastozystenstadium Stufe17, wenn PGCs im Vegetal Pol der Embryo20,21lokalisiert sind. Transplantation vor Gastrulation hat zwei wesentliche Vorteile. Zunächst fand das Engraftment Transplantationen und die anschließende normale Entwicklung effizienter sein, wenn die Transplantation im Blastozystenstadium (unveröffentlichte Beobachtungen) durchgeführt wird. Zweitens durch Blastozystenstadium Transplantationen durchführen, kurz nachdem zygotic Transkription begonnen hat, vermeiden man die Letalität aus Entwicklungsstörungen Gen-Mutationen, die Gastrulation oder das stören sonst zu fehlerhaften späten Neurulae führen. PGC Transplantation-Lager (“leapfrogged”) Embryonen sind gewachsen, Geschlechtsreife und Intercrosses zwischen diesen F0 Tieren haben gezeigt, dass in vielen Fällen 100 % der F-1 -Nachkommen den LOF-Phänotyp (die meisten werden zusammengesetzte anzeigen Heterozygoten), komplette Keimbahn Ersetzung durch gezielte Mutationen angibt.
Es wird erwartet, dass Leap Frogging gentechnische Ansätze im Xenopusbeschleunigen wird. Leap Frogging bietet auch eine Alternative zu den “host-Transfer” Methode22 für die LOF-Analyse von Genen mütterlicherseits-Effekt (unveröffentlichte Beobachtungen). In der aktuellen Publikation präsentiert eine detaillierte Beschreibung der Methode, vor allem mit Schwerpunkt auf PGC Transplantation, in X. tropicalis (mit geringfügigen Änderungen für laevis). Die Transplantation von PGCs beweist hier um einen schnelleren Transfer dieser Technologie an andere Laboratorien arbeiten mit Xenopuszu erleichtern. Die Prinzipien dieser Methode sollte erfolgreich in anderen Amphibien (z.B. Urodeles) und Organismus-spezifische Änderungen in der Methodik dürfen für die Anwendung auf vielen anderen Tieren, die in der effizienten Mutagenese erreicht werden kann und PGCs sind leicht transplantierbaren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieser Bericht enthält ein detailliertes Protokoll für die Transplantation von pflanzlichen Gewebe mit PGCs. Transplantation PGCs in Verbindung mit Genom-Bearbeitung Technologien (z. B. CRISPR/Cas9) verwendet, um die Keimbahn ändern eines Tieres während fast alle seiner somatischen Gewebe aufrechtzuerhalten als genetisch Wildtyp. Für Leap Frogging um erfolgreich zu sein, gibt es eine Reihe von kritischen Faktoren, die vor der Durchführung darstellender Transplantationen.
Um den …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde mit der Unterstützung eines Zuschusses durchgeführt 5R21HD080684-02, aus dem National Institute of Child Health and Human Development. Der Autor bedankt sich bei Ken Cho für seine anhaltende Begeisterung und Unterstützung. Der Autor möchte auch Bruce Blumberg für die Verwendung seiner Kamera, Rebekka Charney, für die kritische Lesung der Handschrift, und Sean McNamara und Marcin Wlizla an der nationalen Xenopus -Ressource (RRID:SCR_013731), bestätigen für die wertvollen Gespräche über X. tropicalis Fütterung und Pflege der Tiere-Regimen.
Materials
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-20 or 11252-30 | |
| Eyebrow hair knife | Homemade | ||
| Hair loop | Homemade | ||
| Pasteur pipettes, borosilicate glass | Fisher Scientific | 13-678-20A | |
| Krazy Glue (Cyanoacrylate-based) | Elmer's Products, Inc. | KG581 | To affix eyebrow hair and hair loops into Pasteur pipettes, other similar glues can be used. |
| Oligodeoxynucleotides, custom ordered | Integrated DNA Technologies | Custom ordered | Template oligos for sgRNA synthesis, see Nakayama et al., 2014 for design details. |
| Megascript T7 kit | Ambion/ThermoFisher | AM1334 | Or use Megashortscript T7 (AM1354) kit |
| Phenol, Tris buffered | High quality distilled phenol from any commercial supplier | ||
| Chloroform | High quality chloroform from any commercial supplier | ||
| Ethanol | High quality ethanol from any commercial supplier | ||
| Diethylpyrocarbonate (DEPC) | Sigma Chemical Co. | D5758-50ML | |
| Cas9 protein, with nuclear localization signal | PNA Bio, Inc. | CP01 | Reconstituted using DEPC-treated water according to manufacturer's recommendations |
| 10X Marc's Modified Ringers solution | Homemade. Recipe (ref 26) for 1X MMR (lacking EDTA) is 100mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 5 mM HEPES. Solution is pH adjusted to 7.4. | ||
| Agarose | Any Molecular Biology grade agarose is sufficient | ||
| 60 X15 mm Petri plates | Falcon | 351007 | |
| 24-well plates | Falcon | 3047 | |
| L-Cysteine | Sigma Chemical Co. | C7352-100G | Free base, not HCl salt |
| Proteinase K | Roche | 03 115 828 001 | Typically ~20mg/ml from Roche |
| sera Micron | sera | Tadpole food. Resuspend in growth medium. Can be purchased from a variety of online retailers |
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