Cirurgia piezoeléctrica conduziu-se a melhorias em cirurgia maxilo-facial e dental humana. Temos desenvolvido um protocolo para otimizar a cirurgia piezoelétrica para cirurgia craniana janela em camundongos.
Microscopia do multiphoton foi amplamente adaptada para imagem neurônios na vivo. Imagem repetida requer a implantação de uma janela cranial ou repetidas afinamento do crânio. Cirurgia craniana janela é normalmente realizada com uma broca rotativa de alta velocidade, e muitos investigadores encontrar desafio para evitar que a broca de danificar o delicado dura-máter e os vasos sanguíneos. Prática e treinamento extensivo é necessária para remover o osso sem dano ao tecido subjacente e assim cirurgia craniana janela pode ser difícil, demorada e produzir danos nos tecidos. Cirurgia piezoeléctrica, que é amplamente utilizada para cirurgia maxilo-facial e dental, utiliza vibrações ultra-sônicas para remover o osso sem danificar os tecidos moles. Nós desenvolvemos um método de aplicação piezoelétrica cirurgia para melhorar a cirurgia craniana janela em camundongos em preparação para a imagem latente do multiphoton. Comparações dentro de nosso laboratório de acham que o método requer menos tempo de cirurgia e tem uma baixa taxa média de complicações devido a sangramento dural que a cirurgia craniana janela com uma broca rotativa.
Cirurgia craniana janela para preparar roedores multiphoton imagem latente na vivo tornou-se uma técnica importante em neurociência. A remoção ou enfraquecimento dos ossos é necessário preparar o mouse para a imagem latente ótica com um microscópio do multiphoton. Esta cirurgia é realizada removendo completamente uma área de osso para expor a dura-máter subjacente1ou diluindo-se uma região do osso sem remoção completa do dura2. A abordagem de crânio fina pode produzir menos inflamação e ativação da microglia3 mas fornece uma profundidade de imagem, um tamanho menor de janela de imagem (200 µm) e um período de tempo limitado durante o qual a janela pode ser fotografada devido à regeneração óssea2 . A adição de uma janela de vidro polido e reforçado (portas) pode aumentar o tamanho de imagem e período de imagem, mas é difícil de executar4.
Ambas as cirurgias atuais usam uma broca rotativa de alta velocidade para diluir ou remover o osso do crânio. A técnica de crânio fina também usa um bisturi após a broca para diluir ainda mais o osso2. A técnica de portas exige a etapa extra de polimento com grão4de alta velocidade. Em uma alta velocidade rotativos, uma turbina de ar alimentado ou motor elétrico faz com que a broca a girar a uma velocidade alta. Como brocas rotativas seção tanto osso e tecido mole, há um risco de danificar a dura-máter e subjacentes dos vasos sanguíneos. O sucesso da cirurgia depende da habilidade do cirurgião. Além destas janelas preparadas com métodos cirúrgicos mecânicos, um método químico de opticamente limpando o crânio com diferentes soluções tem sido desenvolvidos5,6. No entanto, desde cirurgia piezoelétrica é um método mecânico de cirurgia, nossas comparações aqui será limitadas a outros métodos mecânicos.
Piezoelétricos dispositivos cirúrgicos utilizam vibrações ultra-sônicas para quebrar osso mineralizado sem danificar tecidos moles subjacentes e assim, oferecem uma abordagem para desbastar rapidamente uma grande área de osso. Em uma peça de mão cirúrgica piezoelétrica, a turbina é substituída por uma pilha de discos de cerâmica e quando a corrente é aplicada, os discos vibram em frequências ultra-sônicas. As vibrações são transferidas através da peça de mão para diamante revestidas dicas para cortar o osso sem danificar os tecidos moles, uma vantagem sobre brocas rotativas que não discriminar entre os tipos de tecido. Cirurgia piezoeléctrica foi originalmente desenvolvida para uso em humanos por Tomaso Vercellotti e conduziu a melhorias na dental e cranio-maxilofacial cirurgia7,8,9,10,11 .
Piezoelétrica cirurgia tem sido usada para criar uma osteotomia em ratos Wistar e foi encontrada por ressonância magnética (MRI) e histologia para produzir significativamente menos dano do que um tradicional broca dental12. Os autores concluíram que cirurgia piezoeléctrica era segura para remover o osso perto de tecido cerebral macio. Ratos, no entanto, tem uma dura mais fino que é mais facilmente danificado, e esse estudo não preparou windows para a imagem latente ótica crônica. Imagem de crônica requer que os vasos sanguíneos não sejam danificados e que não formam coágulos de sangue sob a janela. Danos para a dura-máter leva a inflamação que faz com que a janela para a nuvem, e ativa a microglia e a proliferação de astrócitos reativos. Aqui, otimizamos cirurgia piezoeléctrica de ratos para criar tanto fino crânio e osso completo remoção craniana windows apropriado para a imagem latente crônica. Comparamos esta técnica cirúrgica para cirurgias cranianas janela preparado com uma broca rotativa de alta velocidade.
A cirurgia pode ser modificada alterando a ponta cirúrgica. Há muitos tamanhos diferentes de ponta que pode ser aplicado à peça de mão. Alterar o tamanho ou a forma da ponta resultará em janelas de tamanhos diferentes. Além da ponta de 4mm, também tentei uma dica de 3 mm e encontrado também funcionou bem. Mesmo com a irrigação com gelo frio ACSF, não fomos capazes de obter bons resultados com dicas que foram muito estreito (cerca de 0,25 mm) devido as vibrações concentradas, causando muito calor e queima o osso, levando a danos para a dura-máter subjacente. Nós não tentamos a multidão de outras dicas que estão disponíveis, e esperamos que outros laboratórios podem encontrar novas aplicações para estas pontas diferentes. Enquanto a cirurgia é relativamente simples, achamos que há várias etapas que podem exigir a resolução de problemas. O primeiro é que a ponta vibratória produz muita turbulência na ACSF, que diminui a visibilidade e produz dificuldade em determinar a profundidade de osso durante o osso desbaste etapa da cirurgia. Recomendamos que, se é muito difícil de ver como o osso é magro, fazer uma pausa para secar o crânio e a janela aplicando um cotonete estéril para o lado do osso. Não se aplica o cotonete diretamente para a janela, desde que a superfície áspera é prejudicial para o osso fino. Depois de verificar a profundidade, reaplique ACSF e continuar com a cirurgia. Também achamos que se não há danos para a dura-máter, é geralmente devido ao cirurgião colocar muita pressão na ponta. Segurando a peça de mão mais suavemente e aplicando menos força provavelmente irão corrigir este problema. Se o cirurgião é forçosamente raspando a dica sobre o osso, vai causar uma ruptura no osso fino e danificar o crânio. Finalmente, após a diluição do osso, a dura-máter subjacente aparece ferida, se devido ao calor em excesso de vibrações. Aumentando a taxa de fluxo ACSF vai resolver este problema.
A principal limitação do FASOR é que a peça de mão pode diluir o osso, mas não é possível remover todo o osso sobre a dura-máter. A ponta de diamante revestido tem pequenas saliências ásperas. O atrito necessário para “afinar” o crânio que abrada a dura-máter e causar sangramento se fosse usado para remover todo o osso. Assim, o uso de fórceps é necessário para remover a restante camada fina. Enquanto há um debate em curso sobre se a imagem através de um crânio fina produz menos inflamação e menos proliferação da microglia e astrócitos reativos, em alguns casos uma janela com nenhum osso remanescente é o preferido, por exemplo, para fornecer uma maior profundidade de imagem3 .
Otimizamos a preparação de janela cranial para a imagem latente do multiphoton em camundongos. FASOR é, a nosso conhecimento, a primeira aplicação da técnica piezoelétrica para cirurgia de roedores janela cranial para a imagem latente ótica. Descobrimos que o uso de cirurgia piezoeléctrica em camundongos compartilha as vantagens do aumento da velocidade e diminuição de eventos adversos relatados também em seres humanos7,8,9,10. Utilização do dispositivo piezoelétrico resultou em cirurgias mais rápidas (Figura 2A) e menos eventos adversos de sangramento quando comparado com uma giratória de alta velocidade da broca (Figura 2B). Também encontramos, no nosso laboratório, que FASOR era mais fácil para novos cirurgiões aprender do que as abordagens tradicionais para cirurgia craniana janela. Vantagens da velocidade e facilidade de utilização são susceptíveis de diferem entre cirurgiões. Preparações de crânio fina exigem tipicamente 30-45 min para “afinar” o osso com uma broca e bisturi2, enquanto a abordagem de FASOR normalmente requer menos de 10 min.
Nós achamos que em windows preparados com PHASOR nós poderia imagem transientes de cálcio nos neurônios piramidais de camada 4 no córtex motor que tinha sido transfected com vírus adeno-associado, o indicador de cálcio JRGECO1a de codificação (AAV9. Syn.NES-jRGECO1a.WPRE.SV40). nós também achamos isso, comparado a uma janela craniana crânio fino preparada com uma broca rotativa e bisturi, a região de imagem era maior, enquanto um crânio fino preparado com uma broca rotativa e bisturi tem uma janela de imagem de 20 µm de diâmetro2 . Com FASOR, fomos capazes de diminuir rapidamente uma área de 3 a 4 mm. Isso é semelhante à janela de imagem relatada com portas4. Esta janela maior retém o benefício de imagem rápida relatado para windows crânio fino preparados com uma broca de dentista e bisturi. Além disso, a janela preparada com FASOR pode imediatamente ser fotografada, em oposição a remoção de osso tradicional windows que podem exigir a semanas para cicatrizar antes que a janela pode ser óptima imagem3.
Esta técnica pode ser aplicada para estudar alterações no fluxo sanguíneo nos vasos sob a dura-máter. Um importante estudo futuro é comparar imunorreatividade de FASOR com outros métodos de janela cranial. Isto seria importante para determinar se o FASOR produz menos inflamação em comparação com os métodos existentes. Esperamos que a técnica cirúrgica piezoelétrica documentada aqui permitirá mais laboratórios para executar windows cranianas e usar com sucesso multiphoton imagem em vivo.
Certifique-se que a peça de mão situa-se a vibrar na configuração mais baixa e que a ACSF está sendo irrigado em uma taxa constante. O frio do gelo que ACSF deve ser aplicado constantemente ou irá aquecer e danificar a dura-máter. Nós achamos que ACSF deve ser aplicado a uma taxa de pelo menos 1 mL/min. quer usar uma seringa realizada na mão, ou usar uma bomba peristáltica, ao invés da irrigação embutida na peça de mão. O sistema de irrigação na peça de mão ejeta ACSF demasiada força e produz muita turbulência, que diminuem significativamente a visibilidade.
The authors have nothing to disclose.
Tamara Zeric para ajudar a obter a imagem do multiphoton neste trabalho. Suportado pelo cérebro & comportamento, Parkinson e fundações JPB, R01 MH108186 e R01 DA07418. F31 comunhão 1F31MH109293-01A1 S c.
Piezosurgery Touch | Mectron | 5120062 | Piezosurgery GP model has the same settings |
Circular 4mm flat piezosurgery tip (# OT11) | Mectron | 3370019 | This tip was ideal for our windows but there are many other tips of different sizes availible. |
Stereotax frame | Kopf | 963 | |
Mouse adaptor | Stoelting | 51625 | |
Peristaltic pump for irrigation. | Cole-Parmer | WU-77120-42 | Makes it easier to irrigate and frees up the other hand to provide stability. Irrigation can be performed by hand with a syringe if necessary. |
Avitene Ultrafoam | Bard-Davol | 1050020 | Important to stop any minor bleeding instantly. |
C&B Metabond | Parkell | S380 | Much stronger than regular dental acrylic. |
Artificial cerebro spinal fluid (ACSF) | Tocris | 3525 | |
Puralube opthalmic ointment | Dechra | 17033-211-38 | |
Mice | JAX | 664 | |
Prairie Ultima multiphoton microscope | Olympus | ||
JRGECO1a (AAV9.Syn.NES-jRGECO1a.WPRE.SV40) | UPENN Vector Core |