Préparation des cellules primaires de leucémie lymphoblastique aiguë en Phases de Cycle de cellules différentes par élutriation centrifuge
Summary
Ce protocole décrit l’utilisation d’élutriation centrifuge pour séparer les cellules primaires de leucémie lymphoblastique aiguë en phases de cycle de cellules différentes.
Abstract
La possibilité de synchroniser les cellules a été essentiel pour faire progresser notre compréhension de la régulation du cycle cellulaire. Les techniques courantes utilisées incluent la privation de sérum ; produits chimiques qui arrêtent les cellules lors des phases d’un cycle cellulaire différent ; ou l’utilisation de mitotique shake-off qui exploite leur adhérence réduite. Cependant, tous ces ont des inconvénients. Par exemple, la privation de sérum fonctionne bien pour les cellules normales, mais moins bien pour les cellules de la tumeur avec compromis cell cycle points de contrôle en raison de l’oncogène activation ou tumor suppressor perte. De même, populations cellulaires traité chimiquement peuvent abriter des dommages causés par les drogues et montrent des altérations liées au stress. Une technique qui contourne ces problèmes est élutriation centrifuge contre-courant (CCE), où les cellules sont soumis à deux forces opposées, la force centrifuge et vitesse du fluide, qui se traduit par la séparation des cellules sur la base de la taille et la densité. Étant donné que les cellules avançant à travers le cycle typiquement agrandir, CCE peut être utilisé pour séparer les cellules en phases de cycle de cellules différentes. Ici, nous appliquons cette technique à des cellules de leucémie lymphoblastique aiguë primaire. Dans des conditions optimales, une population essentiellement pure des cellules en phase G1 et une population fortement enrichie de cellules en phases G2/M peuvent être obtenus avec un excellent rendement. Ces populations de cellules sont idéales pour étudier des mécanismes dépendants du cycle cellulaire d’action des médicaments anticancéreux et pour d’autres applications. Aussi, nous montrent comment les modifications à la procédure standard peut provoquer des performances sous-optimales et discuter les limites de la technique. La méthodologie détaillée présentée devrait faciliter l’application et à l’exploration de la technique à d’autres types de cellules.
Introduction
Les cellules cultivées généralement croissent de façon asynchrone et des cellules individuelles sont présents dans les différentes phases du cycle cellulaire. Certains organismes présentent naturellement synchrone des cycles cellulaires ou peuvent être synchronisées par des stimuli physiologiques spécifiques. Par exemple, les noyaux dans les plasmodes géants du myxomycète Physarum polycephalum divisent dans un mode très synchrone1et les cellules de l’algue que Desmodesmus quadricauda peuvent être synchronisés par une alternance de lumière et l’obscurité périodes2. Tandis que ces organismes offrent des particularités expérimentales, ils modèle insuffisamment les complexités des cellules de mammifères. La possibilité de synchroniser artificiellement les populations cellulaires de mammifères a été essentiel pour faire progresser notre compréhension de la régulation du cycle cellulaire et la base moléculaire du cycle cellulaire points de contrôle. Méthodes courantes sont la privation de sérum, bloc chimique et libération ou d’exploiter les caractéristiques physiques3,4. Retrait du sérum entraîne souvent des cellules entrer dans le repos, et le rajout du sérum favorise rentrée cycle cellulaire en phase G15. Des inhibiteurs chimiques comprennent des agents tels que la thymidine excessive ou hydroxyurée qui bloquent les cellules à la limite de G1/S ou inhibiteurs de microtubules qui arrêtent généralement les cellules en phase M3,4. Les approches qui exploitent les caractéristiques physiques comprennent mitotique shake-off qui peut être utilisé pour enrichir des cellules mitotiques, car ils sont moins adhérents que de cellules interphasiques6. Cependant, toutes ces techniques présentent des inconvénients potentiels. Par exemple, pas tous les types de cellules maintiennent la viabilité en l’absence de sérum ou de la présence d’inhibiteurs chimiques et le rendement des cellules après que shake arrêt mitotique est limité sans synchronisation préalable avec inhibiteurs mitotiques.
À l’exception des premiers cycles cellulaires embryonnaires, où cellules diminuent progressivement en taille comme ils divisent7, avançant à travers le cycle de la plupart des cellules subissent des phases de croissance et de plus en plus. Cette propriété est exploitée en technique d’élutriation centrifuge contre-courant (CCE), qui peut être utilisée pour séparer les cellules différant par taille et par conséquent au cycle cellulaire phase8,9. Au cours de la CCE, les cellules sont sous l’influence de deux forces opposées : la force centrifuge, qui entraîne les cellules de l’axe de rotation et la vitesse du fluide (contre-courant), qui entraîne les cellules vers l’axe de rotation (Figure 1). Les cellules dans la chambre d’élutriation atteint une position d’équilibre où ces forces sont égales. Les principaux facteurs dictant la position d’équilibre sont la densité et le diamètre de la cellule. Comme l’écoulement de la solution tampon est augmenté et la force de traînée de contre-courant l’emporte sur la force centrifuge, un nouvel équilibre est établi, provoquant un changement dans la position des cellules à l’intérieur de la chambre. Toutes les cellules sont décalés vers la sortie de la chambre, ayant pour résultat plus petits laissant la chambre tout d’abord, alors que les plus grosses cellules restent dans la chambre jusqu’à ce que le taux de contre-courant est augmenté suffisamment pour promouvoir leur sortie. Les cellules s’échappant de la chambre d’élutriation avec hausses consécutives des taux de contre-courant peuvent être collectées dans les fractions spécifiques et chaque fraction contient des cellules de croissance séquentielle de tailles. Au lieu de mener élutriation avec des augmentations des taux de contre-courant, séquentiel diminue en force centrifuge en diminuant la vitesse de centrifugation permettra d’atteindre le même résultat. Le processus d’élutriation nécessite optimisation selon le type de cellule, élutriation tampon employées et l’appareillage spécifique utilisé. Le taux de sédimentation des cellules dans ces conditions est mieux décrit par la Loi de Stokes : SV = [d2ρp– ρ (m) / 18η] .ω2r, où SV = vitesse de sédimentation ; d = diamètre de la particule ; Ρ,p = masse volumique de la particule ; Ρm = masse volumique de la mémoire tampon. Η = viscosité de la mémoire tampon. Ω = vitesse angulaire du rotor ; et r = position radiale de la particule. Ainsi, la SV est proportionnelle à la densité et le diamètre de la cellule, et diamètre étant déclenché à la seconde puissance, elle contribue d’une manière plus significative que la densité qui est généralement constante au cours du cycle cellulaire.
Un avantage important du CCE est que les cellules ne sont pas soumises à des conditions difficiles de traitement chimique ou de la privation alimentaire et peuvent être récupérés avec un excellent rendement essentiellement non perturbée. Une exigence est que les cellules en question subissent une augmentation significative de diamètre, d’au moins 30 %, car ils parcourent le cycle cellulaire. Le principal inconvénient est le coût de la centrifugeuse spécialisée, rotor et accessoires. Néanmoins, la possibilité de préparer les cellules enrichies en phases de cycle de cellules spécifiques par le CCE a grandement facilité les recherche sur le cycle cellulaire chez les organismes de levure en cellules mammifères9,10. Par ailleurs, les avancées récentes élargissent utilisations à la séparation des cellules de sain par rapport aux tissus cancéreux, la séparation des différents types de cellules dans les mélanges hétérogènes et à la production de types spécifiques de cellules pour immunothérapie9.
Notre intérêt majeur a été pour comprendre le mécanisme d’action du microtubule ciblant les agents (MTA) tels que les alcaloïdes de la Pervenche et taxanes. Ces médicaments étaient censés agir exclusivement lors de la mitose, bloquant la fonction de microtubules du fuseau11,12, mais des données récentes suggèrent qu’ils peuvent viser aussi interphase microtubules13,14. Nous avons récemment rapporté que les cellules primaires de leucémie lymphoblastique aiguë (tous) subissent la mort en soit la phase G1 ou au m phase que traités par vincristine et d’autres MTA dans un cycle cellulaire-dépendant15. La capacité de séparer toutes les cellules en phases de cycle de cellules différentes par le CCE a contribué pour parvenir à cette conclusion. Dans cet article, nous décrire les détails techniques et offrent des conseils pratiques pour l’application du CCE à la préparation des primaires toutes les cellules en phases de cycle de cellules différentes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous avons décrit une méthode pour l’obtention de primaire toutes les cellules dans les différentes phases du cycle cellulaire à l’aide de la CCE. Dans des conditions optimales une population essentiellement pure des cellules en phase G1 et une population fortement enrichie de cellules en phases G2/M pourraient être facilement obtenus avec d’excellents rendements et cellules fortement enrichis en phase S peuvent également être obtenus si vous le souhaitez. Les résultats présentés ici ont été obtenus à …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par les NIH CA109821 (à la STC). Nous remercions Beckman-Coulter pour fournir généreusement des fonds pour couvrir les frais de publication et d’assistance technique à l’installation et le fonctionnement du système élutriation. Nous remercions le Dr Fred Falkenburg fournissant primaire initiale toutes les cultures.
Materials
| Hanks' balanced salt solution | Lonza | 10-508Q | 1 L bottle |
| Fetal Plus bovine serum | Atlas Biologicals | FP-0500-A | 500 mL bottle |
| 2-napthol-6,8-disulfonic acid dipotassium salt | Acros Organics | 212-672-4 | 100 g powder |
| 50 mL concial tubes | Denville Scientifics | C1062-P | 500/case |
| PES Membrane 0.22 µm filter unit | Millipore | SLGP033RB | 250/pack |
| Avanti J-26S XPI w/ Elut. Non-IVD – 50/60 Hz, 200/208/240V | Beckman Coulter | B14544 | centrifuge compatible with elutriation system |
| JE 5.0 elutriator rotor kit | Beckman Coulter | 356900 | rotor kit which includes the rotor, T-handle hex wrench, the quick release assembly (w/o the elutriation chamber), anchoring cable, and the strobe assembly |
| Chamber, standard, 4-mL, "A" | Beckman Coulter | 356943 | standard elutriation chamber |
| Masterflex L/S Easy-Load pump head | Cole-Parmer | EW-07518-10 | |
| Masterflex L/S Variable-Speed Drive | Cole-Parmer | EW-07528-10 | |
| Masterflex BioPharm platinum-cured silicone pump tubing, L/S 16 | Cole-Parmer | EW-96420-16 | |
| 25 G x 1.5 Precision Glide needle | BD | 305127 | sterile, single-use needles |
| 10 mL Luer-Lok syringe | BD | 309604 | sterile, single-use syringes |
| Vi-Cell XR | Beckman Coulter | 383556 | |
| PI/RNase staining buffer | BD Pharmingen | 550825 | propidium iodide/RNase staining buffer |
| cyclin B1 (GNS1) mouse monoclonal IgG antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-245 | |
| cyclin D1 (DCS-6) mouse monoclonal IgG antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-20044 | |
| P-Rb (S807/811) (D20B12) XPR rabbit monoclonal antibody | Cell Signaling Technology | 8516s | |
| GAPDH (14C10) rabbit monoclonal antibody | Cell Signaling Technology | 2118s | |
| Goat anti-mouse IgG (H+L)-HRP conjugate | BioRad | 170-6516 | |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L)-HRP conjugate | BioRad | 170-6515 |
Referenzen
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