Preparación de las células de la leucemia linfoblástica aguda primaria en diferentes fases de la célula por elutriación centrífugo
Summary
Este protocolo describe el uso de elutriación centrífuga para separar las células de la leucemia linfoblástica aguda primaria en diferentes fases de la célula.
Abstract
La capacidad de sincronizar las células ha sido fundamental para avanzar en nuestra comprensión de la regulación del ciclo celular. Técnicas comunes empleadas incluyen privación de suero; productos químicos que detención de células en ciclo celular diferentes fases; o el uso de mitotic shake que explota su adherencia reducida. Sin embargo, todos estos tienen desventajas. Por ejemplo, hambre de suero funciona bien para las células normales pero menos bien por las células del tumor con puestos de control de ciclo celular comprometida debido a la pérdida de supresores activación o tumor oncogen. Del mismo modo, poblaciones de la célula tratada químicamente pueden daño inducido por la droga del puerto y muestran alteraciones relacionadas con el estrés. Una técnica que evita estos problemas es elutriación centrífuga contracorriente (CCE), donde las células son sometidas a dos fuerzas opuestas, la fuerza centrífuga y la velocidad del fluido, que se traduce en la separación de células en base a tamaño y densidad. Como agrandan las células avanzando a través del ciclo por lo general, la CCE puede utilizarse para separar las células en diferentes fases de la célula. Aquí aplicamos esta técnica a las células de la leucemia linfoblástica aguda primaria. Bajo condiciones óptimas, pueden obtenerse una población esencialmente pura de células en fase G1 y una población altamente enriquecida de células en las fases G2/M en el excelente rendimiento. Estas poblaciones celulares son ideales para estudiar dependiente de ciclo celular mecanismos de acción de drogas contra el cáncer y para otras aplicaciones. También mostramos cómo modificaciones en el procedimiento estándar puede resultan en rendimiento subóptimo y discutir las limitaciones de la técnica. La metodología detallada presentada debe facilitar la aplicación y exploración de la técnica a otros tipos de células.
Introduction
Las células cultivadas crecen típicamente asincrónicamente y las células individuales están presentes en diferentes fases del ciclo celular. Algunos organismos presentan ciclos celulares naturalmente sincrónicos o pueden ser sincronizados por estímulos fisiológicos específicos. Por ejemplo, núcleos de plasmodia gigante del limo molde Physarum polycephalum se dividen en una manera altamente sincrónico1y las células de las algas verdes que desmodesmus quadricauda puede ser sincronizado por la alternancia de claros y oscuros periodos2. Mientras que estos organismos ofrecen atributos experimentales únicos, mal modelo las complejidades de las células de mamífero. La capacidad de sincronizar artificialmente las poblaciones de células de mamífero ha sido fundamental para avanzar en nuestra comprensión de la regulación del ciclo celular y la base molecular de los puntos de control de ciclo celular. Métodos comunes incluyen privación de suero, bloque química y liberación o explotar características físicas3,4. Retiro de suero a menudo hace que las células a entrar en quietud, y la nueva adición de suero promueve el reingreso del ciclo celular en G1 fase5. Inhibidores químicos incluyen a agentes como timidina exceso o hidroxiurea que bloquean las células en el límite de G1/S o inhibidores de los microtúbulos que suelen detención las células en la fase M3,4. Métodos que aprovechan las características físicas incluyen mitotic shake-off que se puede utilizar para enriquecer las células mitotic puesto que son menos adherentes que la interfase las células6. Sin embargo, todas estas técnicas tienen desventajas potenciales. Por ejemplo, no todos los tipos de la célula mantienen viabilidad en ausencia de suero o la presencia de inhibidores químicos y el rendimiento de las células después de mitotic shake es limitada sin sincronización previa con inhibidores de la mitosis.
A excepción de primeros ciclos celular embrionarios, donde células disminuyen progresivamente de tamaño como reparten7, mayoría avanzando a través del ciclo de las células se someten a fases de crecimiento y ser más grandes. Esta propiedad es aprovechada en la técnica de elutriación centrífuga contracorriente (CCE), que puede ser utilizado para separar las células difieren en tamaño y por lo tanto, en el ciclo celular fase8,9. Durante el CCE, las células están bajo la influencia de dos fuerzas opuestas: la fuerza centrífuga, que conduce las células lejos del eje de rotación y la velocidad del fluido (contraflujo), que impulsa las células hacia el eje de rotación (figura 1). Las células en la cámara de elutriación llegan a una posición de equilibrio donde estas fuerzas son iguales. Los factores clave que dictan la posición de equilibrio son densidad y diámetro de la célula. Como el flujo se aumenta la velocidad de la solución tampón y la fuerza de arrastre de contracorriente compensa la fuerza centrífuga, se establece un nuevo equilibrio, provocando un cambio en la posición de las células dentro de la cámara. Todas las células se desplazan hacia la salida de la cámara, dando lugar a los más pequeños, dejando la cámara en primer lugar, mientras que las células más grandes permanecer dentro de la cámara hasta que la tasa de contracorriente se incrementa lo suficiente para promover su salida. Las células de escape de la cámara de elutriación con aumentos consecutivos en la tasa de contracorriente pueden ser colectadas en fracciones específicas y cada fracción contiene células de crecientes secuencialmente los tamaños. En el lugar de realización de elutriación con aumentos incrementales en tasa de contracorriente, secuenciales disminuciones en la fuerza centrífuga al disminuir la velocidad de centrifugación logrará el mismo resultado. El proceso de elutriación requiere optimización dependiendo del tipo de la célula, elutriación buffer empleadas y el aparato específico utilizado. La tasa de sedimentación de las células en estas condiciones es mejor descrita por la ley de Stokes: SV = [d2(ρ – ρpm) / 18η] .ω2r, donde SV = velocidad de sedimentación; d = Diámetro de la partícula; Ρp = densidad de la partícula; Ρm = densidad de la memoria intermedia; Η = viscosidad del tampón; Ω = velocidad angular del rotor; y r = posición radial de la partícula. Así, SV es proporcional a la densidad y el diámetro de la célula, y puesto que el diámetro se eleva a la potencia segunda, que contribuye más significativamente que la densidad que es generalmente constante a través del ciclo celular.
Una ventaja importante del CCE es que las células no están sujetos a duras condiciones del tratamiento químico o privación nutricional y pueden ser recuperadas en el excelente rendimiento de esencialmente imperturbable. Un requisito es que las células en cuestión se someten a un aumento significativo en el diámetro, de al menos el 30%, ya que atraviesan el ciclo celular. La principal desventaja es el costo de la centrífuga especializada, rotor y accesorios. Sin embargo, la capacidad de preparar las células enriquecidas en las fases del ciclo celular específica por CCE ha facilitado enormemente investigación de ciclo celular en organismos de la levadura a las células mamíferas9,10. Por otra parte, los avances recientes están ampliando usos a la separación de las células de saludables versus tejido canceroso, la separación de diferentes tipos de células en mezclas heterogéneas y a la producción de tipos específicos de la célula para inmunoterapia9.
Nuestro mayor interés ha sido comprender el mecanismo de acción de los microtúbulos a agentes (MTA) como alcaloides de la vinca y taxanos. Estos fármacos fueron pensados para actuar exclusivamente en la mitosis, bloqueo del husillo microtubule función11,12, pero la evidencia reciente sugiere que también puedan dirigir interfase microtúbulos13,14. Nos informó recientemente que las células primarios leucemia linfoblástica aguda (toda) someterse a la muerte tanto en la fase G1 o en los M fase cuando fueron tratados con vincristina y otros MTAs en una manera dependiente del ciclo celular15. La capacidad para separar todas las células en diferentes fases de la célula por CCE fue fundamental para llegar a esta conclusión. En este artículo, describimos los detalles técnicos y ofrecen consejos prácticos para la aplicación de camuflaje para la preparación de primaria todas las células en diferentes fases de la célula.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hemos descrito un método para la obtención primaria todas las células en diferentes fases del ciclo celular mediante camuflaje. Bajo condiciones óptimas una población esencialmente pura de células en fase G1 y una población altamente enriquecida de células en las fases G2/M podrían fácilmente obtener en rendimiento excelente, y las células altamente enriquecidas en fase S también pueden obtenerse si se desea. Los resultados aquí presentados se obtuvieron mediante una primaria de que toda cultura (específica…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por NIH CA109821 (a la TCC). Agradecemos a Beckman-Coulter generosamente fondos para cubrir los costos de publicación y de asistencia técnica en la instalación y operación del sistema de elutriación. Agradecemos a Dr. Fred Falkenburg para proporcionar primaria inicial de todas las culturas.
Materials
| Hanks' balanced salt solution | Lonza | 10-508Q | 1 L bottle |
| Fetal Plus bovine serum | Atlas Biologicals | FP-0500-A | 500 mL bottle |
| 2-napthol-6,8-disulfonic acid dipotassium salt | Acros Organics | 212-672-4 | 100 g powder |
| 50 mL concial tubes | Denville Scientifics | C1062-P | 500/case |
| PES Membrane 0.22 µm filter unit | Millipore | SLGP033RB | 250/pack |
| Avanti J-26S XPI w/ Elut. Non-IVD – 50/60 Hz, 200/208/240V | Beckman Coulter | B14544 | centrifuge compatible with elutriation system |
| JE 5.0 elutriator rotor kit | Beckman Coulter | 356900 | rotor kit which includes the rotor, T-handle hex wrench, the quick release assembly (w/o the elutriation chamber), anchoring cable, and the strobe assembly |
| Chamber, standard, 4-mL, "A" | Beckman Coulter | 356943 | standard elutriation chamber |
| Masterflex L/S Easy-Load pump head | Cole-Parmer | EW-07518-10 | |
| Masterflex L/S Variable-Speed Drive | Cole-Parmer | EW-07528-10 | |
| Masterflex BioPharm platinum-cured silicone pump tubing, L/S 16 | Cole-Parmer | EW-96420-16 | |
| 25 G x 1.5 Precision Glide needle | BD | 305127 | sterile, single-use needles |
| 10 mL Luer-Lok syringe | BD | 309604 | sterile, single-use syringes |
| Vi-Cell XR | Beckman Coulter | 383556 | |
| PI/RNase staining buffer | BD Pharmingen | 550825 | propidium iodide/RNase staining buffer |
| cyclin B1 (GNS1) mouse monoclonal IgG antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-245 | |
| cyclin D1 (DCS-6) mouse monoclonal IgG antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-20044 | |
| P-Rb (S807/811) (D20B12) XPR rabbit monoclonal antibody | Cell Signaling Technology | 8516s | |
| GAPDH (14C10) rabbit monoclonal antibody | Cell Signaling Technology | 2118s | |
| Goat anti-mouse IgG (H+L)-HRP conjugate | BioRad | 170-6516 | |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L)-HRP conjugate | BioRad | 170-6515 |
Referenzen
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