שיטות אלטרנטיביות במבחנה מצפני Capsid ויראלי המבנית

Summary

שיטות איתור שגרתית ניצול גנום ויראלי הגברה מוגבלים על ידי חוסר יכולתם להפלות זיהומיות של חלקיקים שאינן זיהומיות. מטרת מאמר זה נועד לספק נתונים היסטוריים פרוטוקולים עבור שיטות אלטרנטיביות לסייע אפליה של חלקיקים norovirus זיהומיות באמצעות איגוד aptamer, פיזור אור דינאמי במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים.

Abstract

האדם norovirus האסלאם נוקם בריאות הציבור ניכר והפסדים כלכליים ברחבי העולם. מתעוררים במבחנה טיפוח ההתקדמות עדיין אינם ישימים עבור זיהוי שגרתית של הנגיף. כימות טכניקות, אשר מסתמך בעיקר על הגברה חומצת גרעין, וזיהוי הנוכחי לא להפלות זיהומיות של נגיפים שאינן זיהומיות. מטרת מאמר זה היא להציג פרטים ספציפיים על ההתקדמות טכניקות המשמשות ביחד כדי לקבל עוד מידע על מצב infectivity של נגיפים. טכניקה אחת כוללת הערכת קשירה של aptamer ssDNA norovirus כדי capsids. Aptamers יש את היתרון של להיות מסונתז בקלות והוא שונה, ויש זול ויציב. טכניקה נוספת, דינאמי פיזור אור (DLS), יש את היתרון של התנהגות capsid בפתרון. מיקרוסקופ אלקטרונים מאפשר הדמיה של שלמות המבנה של capsids נגיפי. למרות והבטיחה, יש מספר חסרונות כל טכניקה, כגון aptamer שאינם ספציפיים מחייב מפרוטונים שמטענם מולקולות של מטריצות לדוגמה, הדרישה של capsid מטוהרים עבור DLS, ורגישות המסכן עבור מיקרוסקופ אלקטרונים. ובכל זאת, כאשר שיטות אלה משמשים בשילוב, הגוף של נתונים המיוצר מספק מידע מקיף יותר על תקינות capsid norovirus ניתן להסיק infectivity, מידע חיוני עבור הערכה מדויקת של השתקה של כרומוזום שיטות או פרשנות של וירוס האיתור. מאמר זה מספק פרוטוקולים בשיטות אלה להפלות norovirus האנושי זיהומיות חלקיקים.

Introduction

Norovirus האנושי הוא אחראי על נטל ניכר בבריאות הציבור ברחבי העולם, גורם על 685 מיליון מחלות ותמותה 212,000 מדי שנה¹, בעלות של מיליארדים של דולרים^2,3. היום, norovirus זיהוי, כימות כרוך הגנום הגברה ו/או פלטפורמות מבוססות-ליגנד. הראשון הוא בדרך כלל עדיף כפי שהוא רגיש יותר, מספק מידע כמותי, יש סיכון נמוך יותר באופן כללי של תוצאות חיוביות שגויות⁴. הנפוץ ביותר norovirus זיהוי, כימות הגנום הגברה הטכניקה היא תגובת שרשרת של פולימראז כמותיים רוורס טרנסקריפטאז (RT-qPCR). כי היא מטרות, מגביר את מקטע קטן של הגנום האנושי norovirus, RT-qPCR לבד אינה מסוגלת האפליה בין זיהומיות ופגעו חלקיקים שאינן זיהומיות, כמו ה-RNA הגנומי חינם, capsids המכיל הגנום, capsids עם אנושות מוטציה/קטום הגנום יכול עדיין להיות מוגבר על ידי RT-qPCR. בעוד שני במבחנה הטיפוח-תרגול טכניקות חדשות norovirus אנושי^5,6 דווחו לאחרונה, שניהם עדיין לסמוך על RT-qPCR על וירוס כימות, עדיין לא ריאלי שיטות שגרתיות קליני/סביבתיים בדיקת noroviruses האנושית. לפיכך, RT-qPCR נשאר תקן הזהב בדיקה קלינית/סביבתיים.

שיטות אחרות במבחנה פותחו במטרה להעריך טוב יותר את המצב infectivity של חלקיקים norovirus. שיטות אלה יכולים להיות מסווגים בדרך כלל כ אלה המטפלות שלמות capsid norovirus ואלה הערכת תקינות הגנום. הגישה פופולרי יותר. השיטה הנפוצה היא RNase רעלני לפני מיצוי של נגיפי RNA הגנומי, אולם זה אינו חשבון נגיפים נשארים בעינם, אך חוסר היכולת לאגד מארח קולטנים/co-גורמים, כמו גם חלקיקים נגיפיים כי יש מוטציה אנושות או יש נחתך או שולית פגום הגנום⁷. שלמות capsid גם ניתן להעריך בהתבסס על היכולת של הווירוס כדי לאגד norovirus האנושי co-receptor/co-גורמים, אשר הם פחמימות המכונה אנטיגנים קבוצה היסטו-דם (HBGAs). HBGAs נמצאים בתאי האפיתל במעי מארח כחלק glycoproteins או glycolipids (בין מספר רקמות אחרות), עשוי להיות מופרש בנוזלי גוף שונים כמו רוק. בה חיידק המכילים חומרים דמויי-HBGA על משטחים שלהם יש גם הוכח כדי לאגד norovirus האנושי^8,9,10, אינטראקציות כאלה עשויים לקדם norovirus זיהום⁵. התפיסה הבסיסית של ניצול HBGA מחייב הוא כי רק מסוגל מחייב את בשם הקולטן/co-factor נגיפים יהיה מסוגל להדביק תאים. מחקרים רבים מראים כי מבוסס-חרוז איגוד HBGA שקדמו חומצת גרעין הגברה היא שיטה מבטיחה infectivity אפליה^{11,12,13,14, 15,16}. האתגר העיקרי לגבי HBGAs היא כי אין סוג HBGA יחיד באפשרותך לאגוד כל norovirus אנושיים אחרים. כדי לטפל בבעיה זו, שימש חזירי mucin קיבה, אשר מכיל HBGAs, במקום פחמימות מטוהרים HBGA כדי לשמור על נוחות של סינתזה, עקביות, עלות מופחתת.

פרסום זה התבצעה על ידי מור. et al. ¹⁷ הציג סט של טכניקות חדשות עבור הערכת תקינות capsid norovirus אנושי. במקום HBGAs, מור. et al. ¹⁷ חקרו את הכריכה של חומצת גרעין בהרחבה תגובתי aptamer (M6-2)¹⁸ ו ש GII.4 סידני שילדת norovirus capsids (חלקיקים דמויי וירוס או האח מים)¹⁹ בהרחבה תגובתי נוגדנים חד שבטיים (NS14), לעומת זאת על הכריכה כדי HBGAs סינתטי. חומצת גרעין aptamers הם קצר (~ 20-80 nt) יחיד נטושים חומצות גרעין (ssDNA או RNA) לקפל לתוך מבנים תלת מימדיים ייחודיים כתוצאה הרצף שלהם, לאגד מטרה. כי הם חומצות גרעין, הם פחות יקר; בקלות כימית מסונתז מטוהרים, שונה; יציב לחום קיימים מספר דיווחים של aptamers שנוצר נגד noroviruses, עם חלק מהם מציג תגובתיות רחב מגוון של זנים^18,20,21,22. דוגמה, מור. et al. ¹⁷ הפגינו את aptamer M6-2 קשורה norovirus האנושי מטוהרים, שהורכב capsids (האח מים) ו התנהגה באופן דומה כדי HBGA והתלות capsid ויראלי כדי לשמור על מבנה החלבון סדר (למשל, משניות ושלישוניות) גבוה יותר עבור כריכת להתרחש. מצד שני, חלק ניכר norovirus האח מים מחייב נוגדן NS14 נותרה לאחר היו capsids שפגע בסימני לחלוטין. הערכה של איגוד norovirus במחקר על ידי מור. et al. ¹⁷ נעשתה באמצעות שיטה פשוטה, המבוססים על צלחת דומה, אליסה, למעט כי aptamers משמשים במקום נוגדנים (ומכאן השיטה נקראה ELASA). זו השיטה הניסיונית של תפוקה גבוהה שימש כדי להעריך את ההשפעות של טיפולים שונים על capsid norovirus, עבודה זה חשוב להבנת המנגנון של איון ויראלי בתגובה לחשיפה לחצים פיזי או כימי. עם זאת, חסרון אחד לשיטה זו הוא נמוך יותר רגישות חוסר סובלנות כלפי מזהמים מטריקס-הקשורים ברמות גבוהות יותר, הגורמות מחייב שאינם ספציפיים על-ידי aptamers.

מור. et al. ¹⁷ להשתמש בשיטה אחרת, אור דינאמי פיזור (DLS), כדי לפקח על צבירה של נגיפים בתגובה טיפול בחום. DLS משמש בדרך כלל כדי להעריך את הגודל של ננו-חלקיק המתלים, הורחבה חלבונים^23,24 ווירוסים^25,26,27. עוצמת האור מפוזר על ידי חלקיקים בתמיסה תנודות כפונקציה של גודל החלקיקים, המאפשר חישוב מקדם דיפוזיה ולאחר מכן קוטר חלקיקים באמצעות נוסחות ומבוססת. הטכניקה DLS יכולים להבחין הקוטר hydrodynamic של חלקיקים התפזרו עד הננומטרי, המאפשר זיהוי של וירוסים התפזרו, חלבונים capsid בודדים או הדימרים אגרגטים וירוס מבוסס על גודל²⁷. מצבור וירוס, המיוצג על-ידי עלייה גודל החלקיקים, הוא מרמז על אובדן של capsid שלמות. Capsid הוא שפגע בסימני, המבנה שלו משובשות, שאריות הידרופובי הופכים חשופים וגורמים החלקיקים להישאר ביחד ויוצרים אגרגטים. DLS יכול לשמש כדי למדוד את גודל החלקיקים לאחר טיפול שצוין או את קינטיקה של מצבור בזמן אמת^17,28. בשיטה זו יש את היתרון של ומאפשר תצפית בהתנהגות capsid בפתרון אך דורש ריכוז גבוה של capsid מטוהרים, אשר ייתכן שאינו לגמרי נציג של הוירוס במצבו הטבעי.

השיטה האחרונה מנוצל על ידי מור. et al. ¹⁷ היה במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים (TEM). למרות ששיטה זו חסר רגישות, אינו מייצר נתונים כמותיים, היא מאפשרת הדמיה של ההשפעות של טיפולים שונים על המבנה capsid ויראלי. למרות שלא עדיין אידיאלי עבור הגדרות קליני/סביבתיים, השימוש בשיטות אלה בשילוב הוא חשוב בהבנת האדם norovirus איון. מטרת מאמר זה היא לספק פרוטוקולים מעמיק המבוסס על צלחת איגוד וזמינותו (ELASA), DLS, והשתמשו בשיטות הכנה TEM כדי לחקור את ההשפעות של טיפולים תרמיים על capsid norovirus בהקשר של ההשפעות של הטיפולים על capsid שלמות כפי שהוצג במור. et al. ¹⁷.

Protocol

1. מבוססת על צלחת איגוד וזמינותו עבור הערכת אובדן של סדר Norovirus Capsid למבנה גבוה הערה: פרוטוקול ELASA דומה מאוד לאחד המוצגים כאן כבר פורסם 29, מבחני ELASA דומה בעבר דווחו חלק ממחקר מאמרים במקום 17 , 18 , 22- טיפול ?…

Representative Results

השלמות. המבנית של האדם norovirus סידני GII.4 capsids (האח מים) הוערכה באמצעות מספר שיטות רומן כפי שהוצגו על ידי מור. et al. 17. קודם כל, נעשה ניסוי שהיו על capsids השלמות כפונקציה של היכולת שלהם לאגד בשם קולטן/co-factor (HBGA) או של ssDNA aptamer (M6-2) בהשוואה (איור 1). התוצאו…

Discussion

הפרוטוקול ואת הטכניקות המתוארות כאן מספקים אמצעי הערכת norovirus האנושי capsid תקינות/הפונקציונליות של…. שיטות אלה יכול לשמש להשגת תובנה מכניסטית ההשפעות של איון טיפולים נגד הנגיף, באופן פוטנציאלי יכול לשמש כתוספת מסורתיים יותר שיטות ההערכה איון כמו assay RT-qPCR או פלאק. למשל, הערכת איון כימיים או פ?…

Materials

Plate-Based Binding Assay for Evaluating Loss of Higher Order Norovirus Capsid Structure
96-well, medium-binding polystyrene EIA plate	Fisher (Costar)	07-200-36
Lid for 96-well plate	Thermo Fisher	3098
Paraffin film (Parafilm)	Thermo Fisher	PM999
1x PBS (pH 7.2)	Life Technologies	20012-050
Polysorbate 20	Sigma-Aldrich	P9416
1x PBS (pH 7.2) + 0.05% Polysorbate 20	N/A	N/A
Purified, assembled human norovirus GII.4 capsids	N/A	N/A
Individual 0.2 ml PCR tubes	Genesee Scientific	22-154G
2 thermocyclers	Bio-Rad	1861096
Tabletop mini centrifuge	Fisher Scientific	12-006-901
Skim milk solids	Thermo Fisher	LP0031B
Synthetic histo-blood group type A disaccharide, biotinylated	Glycotech	01-017
Biotinylated aptamer M6-2 (stock concentration 100 µM in nuclease-free water): 5'-/5Biosg/AGTATACGTATTACCTGCAGCTGGGAAGAGGTCCGGTAAATGCAGGGTCAGCCCGGAGAGCGATATCTCGGAGATCTTGC -3’	Integrated DNA Technologies	N/A
Streptavidin-horseradish peroxidase conjugate (ELISA grade), We use Life Technologies SNN2004	Life Technologies	SNN2004
3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine (TMB) substrate, room temperature	Thermo Fisher	50-76-00
1 M phosphoric acid	N/A	N/A
Microplate reader capable of reading 450 nm	Tecan	Infinite m200 Pro
Name	Company	Catalog Number	Comments
Analysis of Plate-Based Assay Results
Microsoft Excel or similar program	N/A	N/A
Name	Company	Catalog Number	Comments
Dynamic Light Scattering Experiments
Zetasizer ZSP, or similar particle size analysis instrument	Malvern Instruments	N/A
Vortex	Fisher Scientifc	02-215-365
Quartz cuvette	Hellma	104-002-10-40
Small volume disposable cuvette (to reduce VLP use)	Malvern Instruments	ZEN0040
Name	Company	Catalog Number	Comments
Transmission Electron Microscopy Sample Preparation
Nickel electron microscopy grids with carbon support film	Ladd Research	10880-100
Self-closing reverse electron microscopy tweezers	Ted Pella	5372-NM
Qualitative filter paper	Sigma-Aldrich (Whatman)	WHA1002055
Glass petri dishes	Sigma-Aldrich	BR455743
100 mM stock HEPES solution (pH 7.2)	N/A	N/A
2% uranyl acetate	N/A	N/A