Métodos de alternativas In Vitro para a determinação da integridade estrutural do capsídeo Viral

Summary

Métodos de deteção de rotina utilizando a amplificação do genoma viral são limitados pela sua incapacidade de discriminar infecciosas de partículas não-infecciosas. O objetivo deste artigo é fornecer protocolos detalhados para métodos alternativos ajudar na discriminação de partículas infecciosas norovírus usando vinculação aptamer, espalhamento dinâmico de luz e microscopia eletrônica de transmissão.

Abstract

Norovirus humano exige considerável da saúde pública e prejuízos econômicos em todo o mundo. Emergentes em vitro avanços de cultivo não são ainda aplicáveis para rotina detecção do vírus. A atual detecção e técnicas de quantificação, que dependem principalmente de amplificação de ácidos nucleicos, não discriminamos infecciosas de partículas virais não infecciosas. O objetivo deste artigo é apresentar detalhes específicos sobre recentes avanços em técnicas usadas em conjunto a fim de adquirir mais informações sobre o status de infecciosidade de partículas virais. Uma técnica envolve avaliar a vinculação de um norovírus ssDNA aptamer para capsids. Aptamers tem a vantagem de ser facilmente sintetizado e modificado e são baratos e estável. Outra técnica, dinâmica, espalhando luz (DLS), tem a vantagem de observar o comportamento do capsídeo em solução. Microscopia eletrônica permite a visualização da integridade estrutural dos capsids do virais. Apesar de promissor, existem alguns inconvenientes para cada técnica, tais como específico aptamer ligação às moléculas de carga positiva de matrizes de amostra, exigência de capsídeo purificada por DLS e sensibilidade pobre para microscopia eletrônica. No entanto, quando estas técnicas são usadas em combinação, o corpo de dados produzidos fornece informações mais abrangentes na integridade de capsídeo norovírus, que pode ser usada para inferir a infecciosidade, informação que é essencial para a avaliação exata do métodos de inativação ou interpretação de detecção de vírus. Este artigo fornece protocolos para usar esses métodos para discriminar partículas infecciosas norovírus humano.

Introduction

Norovirus humano é responsável por um peso considerável da saúde pública globalmente, causando doenças aproximadamente 685 milhões e 212.000 mortes anualmente¹, com um custo de bilhões de dólares,^2,3. Hoje, quantificação e deteção de norovírus envolve a amplificação do genoma e/ou plataformas baseadas em ligante. O primeiro é geralmente preferido, pois é mais sensível, fornece informações quantitativas e tem geralmente menor risco de resultados falso-positivos⁴. A técnica mais comum norovírus deteção e quantificação do genoma amplificação é reação em cadeia da polimerase quantitativa transcriptase reversa (RT-qPCR). Porque metas e amplifica um pequeno segmento do genoma humano norovírus, RT-qPCR sozinho não é capaz de discriminar entre infecciosas e partículas não-infecciosas, como a enciclopédia do RNA genômico, danificaram capsids contendo genomas e capsids com fatalmente uma mutação/truncado genomas ainda podem ser amplificadas por RT-qPCR. Enquanto dois novos em vitro técnicas de cultivo para o norovírus humano^5,6 têm sido relatadas recentemente, ambos ainda contam com o RT-qPCR para quantificação de vírus e ainda não são métodos viáveis para rotina clínica e ambiental testando os norovírus humanos. Assim, RT-qPCR continua a ser o padrão ouro para testes clínicos/ambientais.

Outros métodos em vitro foram desenvolvidos na tentativa de melhor estimar o status de infecciosidade das partículas norovírus. Esses métodos geralmente podem ser categorizados como aqueles que abordam a integridade do capsídeo norovírus e os avaliar a integridade do genoma. A primeira abordagem é mais popular. Um método comumente usado é pré-tratamento de RNase antes da extração do RNA genômico viral, no entanto, isso não conta para partículas virais que permanecem intactos, mas faltam a capacidade de se ligar a receptores/co-fatores do hospedeiro, bem como partículas virais que fatalmente se transformaram ou tem truncado ou marginalmente danificado genomas⁷. Integridade do capsídeo também pode ser avaliada com base na capacidade do vírus para vincular a norovírus humano co-receptor/co-fatores, que é carboidratos conhecidos como antígenos de grupo do histo-sangue (HBGAs). HBGAs estão presentes em células epiteliais intestinais do hospedeiro, como parte de glicoproteínas ou glicolipídios (entre vários outros tecidos) e podem ser secretadas em fluidos corporais como saliva. Bactérias entéricas contendo substâncias HBGA, como em suas superfícies também foram mostradas para vincular o norovírus humano^8,9,10, e tais interações podem promover norovírus infecção⁵. O conceito básico de utilizando a ligação de HBGA é que apenas partículas virais capazes de ligação para o putativo do receptor/co-factor seria capazes de infectar as células. Vários estudos sugerem que o grânulo HBGA vinculação anterior a amplificação do ácido nucleico é um método promissor para infecciosidade discriminação^{11,12,13,14, 15,16}. Um grande desafio em matéria de HBGAs é que nenhum tipo HBGA pode ligar todos os genótipos de norovírus humano. Para resolver isso, porcina mucina gástrica, que contém HBGAs, tem sido utilizada em substituição de carboidratos HBGA purificados por razões de facilidade de síntese, coerência e custo reduzido.

Uma recente publicação pela Moore et al . ¹⁷ introduziu um conjunto de novas técnicas para estimar a integridade do capsídeo norovírus humano. No lugar de HBGAs, Moore et al . ¹⁷ investigou a ligação de um amplamente reativo ácido nucleico aptamer (M6-2)¹⁸ e amplamente reativa anticorpo monoclonal (NS14)¹⁹ ao tratado termicamente capsids de norovírus Sydney GII.4 (vírus-como partículas ou VIPs) e comparou-o para a ligação de HBGAs sintéticos. Aptamers de ácidos nucleicos são curtos (~ 20-80 nt) único encalhado ácidos nucleicos (ssDNA ou RNA) que dobre em estruturas tridimensionais únicas como consequência de sua sequência e vincular um alvo. Porque eles são ácidos nucleicos, eles são menos onerosos; facilmente quimicamente sintetizado, purificado e modificado; e estável ao calor. Existem vários relatos de aptamers gerados contra norovírus, com alguns deles mostrando ampla reatividade para uma variedade de cepas^18,20,21,22. A título de exemplo, Moore et al . ¹⁷ demonstrou que aptamer M6-2 acoplado a capsids norovírus humano purificado, montado (VLP) e se comportou da mesma forma para HBGA na dependência de capsídeo viral para manter a estrutura de proteína mais elevada ordem (por exemplo, secundária e terciária) para ligação para ocorrer. Por outro lado, uma proporção significativa de vinculação de norovírus VIP ao anticorpo NS14 permaneceu depois que capsids foram totalmente desnaturados. Avaliação da vinculação de norovírus no estudo de Moore et al . ¹⁷ foi feito usando um método simples, baseado em placa, semelhante ao ELISA, com a exceção de que aptamers são usados no lugar de anticorpos (portanto, o método foi chamado ELASA). Esse método experimental de alta taxa de transferência foi utilizado para avaliar os efeitos de diferentes tratamentos na capsídeo norovírus, trabalho que é valioso para a compreensão do mecanismo de inactivação viral após a exposição a estressores físicos ou químicos. No entanto, uma desvantagem para esse método é a baixa sensibilidade e falta de tolerância para contaminantes matriz associada a níveis mais elevados que causam inespecificas por aptamers.

Moore et al. ¹⁷ usado outro método, luz dinâmica espalhamento (DLS), para monitorar a agregação de partículas virais em resposta a um tratamento térmico. DLS é comumente usado para avaliar o tamanho de suspensões de nanopartículas e foi estendido para proteínas^23,vírus e^{24 25,26,27}. A intensidade da luz espalhada por partículas em solução varia em função do tamanho da partícula, permitindo o cálculo do coeficiente de difusão e, em seguida, diâmetro de partículas utilizando fórmulas bem estabelecidas. A técnica DLS pode distinguir o diâmetro hidrodinâmico de partículas dispersas até à escala nanométrica, que permite a detecção de vírus dispersos, proteínas do capsídeo individuais ou dímeros e agregados de vírus com base no tamanho²⁷. Agregação de vírus, representada por um aumento no tamanho da partícula, é indicativa de perda de integridade do capsídeo. Como capsídeo é desnaturado e atrapalha a sua estrutura, resíduos hidrofóbicos se tornam expostos e fazer com que as partículas que nos juntar e formar agregados. DLS pode ser usado para medir o tamanho de partícula após um tratamento especificado ou a cinética de agregação em tempo real^17,28. Este método tem a vantagem de permitir a observação do comportamento do capsídeo em solução, mas requer altas concentrações de capsídeo purificado, que pode não ser inteiramente representativo do vírus em seu estado natural.

O método final utilizado por Moore et al . ¹⁷ foi a microscopia eletrônica de transmissão (TEM). Embora este método não tem sensibilidade e não gerar dados quantitativos, permite a visualização dos efeitos de diferentes tratamentos sobre a estrutura do capsídeo viral. Embora não ainda ideal para configurações clínicas/ambiental, a utilização desses métodos em combinação é valiosa na compreensão humana norovírus inactivação. O objetivo deste artigo é fornecer protocolos em profundidade para o ensaio de vinculação baseada em placa (ELASA), DLS, e métodos de preparação TEM usado para investigar os efeitos de tratamentos térmicos no capsídeo norovírus no contexto dos efeitos dos tratamentos no capsídeo integridade, tal como apresentado no Moore et al . ¹⁷.

Protocol

1. baseados em placa de ensaio de vinculação para avaliar perda de maior ordem norovírus capsídeo estrutura Nota: um protocolo ELASA muito semelhante ao que aqui apresentado tem sido publicado 29, e ensaios ELASA semelhantes anteriormente foram relatados como parte da pesquisa em outro lugar artigos 17 , 18 , 22. Tratamento térmico de norovírus hum…

Representative Results

A integridade estrutural do norovírus humano capsids de Sydney GII.4 (VIPs) foi avaliada usando vários métodos de romance, tal como apresentado por Moore et al 17. em primeiro lugar, uma experiência foi feita que a integridade dos capsids em função da sua capacidade de se ligar um putativo do receptor/co-factor (HBGA) ou aptamer ssDNA (M6-2) foram comparados (Figura 1). Os resultados exibidos anteriormente apresentados p…

Discussion

O protocolo e as técnicas descritas aqui fornecem um meio de avaliar o norovírus humano capsídeo integridade/funcionalidade. Esses métodos podem ser usados para obtenção de uma visão mecanicista sobre os efeitos dos tratamentos de inactivação contra o vírus e potencialmente podem complementar mais tradicionais métodos de avaliação de inactivação como RT-qPCR ou placa de ensaio. Por exemplo, a avaliação de inativação química ou física por ensaio de placa sozinho fornece uma medida do grau de inativaç…

Materials

Plate-Based Binding Assay for Evaluating Loss of Higher Order Norovirus Capsid Structure
96-well, medium-binding polystyrene EIA plate	Fisher (Costar)	07-200-36
Lid for 96-well plate	Thermo Fisher	3098
Paraffin film (Parafilm)	Thermo Fisher	PM999
1x PBS (pH 7.2)	Life Technologies	20012-050
Polysorbate 20	Sigma-Aldrich	P9416
1x PBS (pH 7.2) + 0.05% Polysorbate 20	N/A	N/A
Purified, assembled human norovirus GII.4 capsids	N/A	N/A
Individual 0.2 ml PCR tubes	Genesee Scientific	22-154G
2 thermocyclers	Bio-Rad	1861096
Tabletop mini centrifuge	Fisher Scientific	12-006-901
Skim milk solids	Thermo Fisher	LP0031B
Synthetic histo-blood group type A disaccharide, biotinylated	Glycotech	01-017
Biotinylated aptamer M6-2 (stock concentration 100 µM in nuclease-free water): 5'-/5Biosg/AGTATACGTATTACCTGCAGCTGGGAAGAGGTCCGGTAAATGCAGGGTCAGCCCGGAGAGCGATATCTCGGAGATCTTGC -3’	Integrated DNA Technologies	N/A
Streptavidin-horseradish peroxidase conjugate (ELISA grade), We use Life Technologies SNN2004	Life Technologies	SNN2004
3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine (TMB) substrate, room temperature	Thermo Fisher	50-76-00
1 M phosphoric acid	N/A	N/A
Microplate reader capable of reading 450 nm	Tecan	Infinite m200 Pro
Name	Company	Catalog Number	Comments
Analysis of Plate-Based Assay Results
Microsoft Excel or similar program	N/A	N/A
Name	Company	Catalog Number	Comments
Dynamic Light Scattering Experiments
Zetasizer ZSP, or similar particle size analysis instrument	Malvern Instruments	N/A
Vortex	Fisher Scientifc	02-215-365
Quartz cuvette	Hellma	104-002-10-40
Small volume disposable cuvette (to reduce VLP use)	Malvern Instruments	ZEN0040
Name	Company	Catalog Number	Comments
Transmission Electron Microscopy Sample Preparation
Nickel electron microscopy grids with carbon support film	Ladd Research	10880-100
Self-closing reverse electron microscopy tweezers	Ted Pella	5372-NM
Qualitative filter paper	Sigma-Aldrich (Whatman)	WHA1002055
Glass petri dishes	Sigma-Aldrich	BR455743
100 mM stock HEPES solution (pH 7.2)	N/A	N/A
2% uranyl acetate	N/A	N/A