Иммобилизация Caenorhabditis elegans для анализа внутриклеточного транспорта в нейроны
Summary
Caenorhabditis elegans (C. elegans) является хорошей моделью для изучения аксональное и внутриклеточного транспорта. Здесь я описать протокол в vivo записи и анализа аксональное и intraflagellar транспорта в C. elegans.
Abstract
Аксональное и intraflagellar транспорта (IFT) имеют важное значение для axon и реснички морфогенеза и функции. Белки суперсемейства Кинезин и Динеин являются Молекулярные двигатели, которые регулируют антероградная и ретроградным транспорта, соответственно. Эти двигатели используют микротрубочек сети как рельсы. Caenorhabditis elegans (C. elegans) представляет собой мощную модель организм для изучения аксональное транспорта и IFT в естественных условиях. Здесь, я описать протокол соблюдать аксональное транспорта и IFT в жизни C. elegans. Транспортировка грузов могут быть визуализированы путем маркировать белки грузов с использованием флуоресцентных белков, таких как Зеленый флуоресцентный белок (ГПУП). C. elegans является прозрачным и белки GFP-тегами груза может быть выражен в конкретных ячеек под клеток конкретных промоутеров. Живые черви может быть исправлено микрошарики на 10% агарозном геле без убийства или обезболивающим червей. В этих условиях движение грузов напрямую можно наблюдать в аксонов и реснички жизни C. elegans без вскрытия. Этот метод может применяться для наблюдения за любой молекулы грузов в любые клетки путем изменения целевых белков и/или ячейки, на которые они выражаются в. Самые основные белки как молекулярные моторы и адаптер белки, которые участвуют в аксональное транспорта и IFT сохраняются в C. elegans. По сравнению с другими модельных организмов, мутанты можно получить и более легко поддерживать в C. elegans. Сочетая этот метод с различными C. elegans мутанты могут уточнить молекулярных механизмов аксональное транспорта и IFT.
Introduction
Живых клеток является важным инструментом для анализа внутриклеточного транспорта. В нейрональных клеточной биологии анализ аксональное транспорта с живых клеток имеют важное значение для понимания нейронов функции и морфогенез1. Дефекты в аксональное транспорта лежат в основе нескольких нейродегенеративных расстройств2. Белки суперсемейства Кинезин и Динеин выполняют аксональное транспорта anterogradely и retrogradely, соответственно1,2.
Реснички являются еще один сотовый отсек, в котором сети микротрубочек и людьми машины являются высоко развитой3. Машины синтеза белка не локализуется в ресничек, что означает, что цилиарной белки должны перевозиться из цитоплазмы в советы ресничек. Специфичные для ресничек Кинезин и Динеин, называемый кинезин-2 и цитоплазматических Динеин-2, соответственно, транспортные компоненты реснички4, в явление под названием intraflagellar транспорта (IFT)5. Обесценение IFT вызывает спектр заболеваний, под названием ciliopathies6. Таким образом анализ механизма IFT живых клеток требуется понять основные механизмы цилиарной формирования и патогенеза.
Caenorhabditis elegans (C. elegans) является хорошей моделью для изучения аксональное транспорта и IFT7,8,9. Соблюдать IFT, Хламидомонада широко используется как модель организма5,6. Хламидомонада это одноклеточные организм, отношения IFT функцией старения, нейронов, и будет трудно анализировать поведение. Кроме того основные генетические методы например ТРИФОСФАТЫ/Cas9 не были применены к Хламидомонада. В высших организмов модели, такие как мышей и дрозофилысрыв аксональное транспорта и IFT часто вызывает смертоносных фенотипов, потому что аксональное транспорта и IFT необходимы для морфогенеза и гомеостаз животных 10, 11. В случае мышей культуры клеток и transfection обычно необходимо соблюдать аксональное транспорта и IFT, которая требует много навыков и обширные время12,13. Кроме того много важных физиологических контекста может быть потеряно в культивируемых клеток и клеточных линий. Потому, что нервная система не является жизненно важным для выживания червей, C. elegans мутантов в котором аксональное транспорта или IFT нарушается зачастую не смертельное7,9,14. Аксональное транспорта и IFT можно непосредственно наблюдать в естественных условиях без вскрытия потому что C. elegans является прозрачным и поэтому легко наблюдать GFP-тегами маркеров.
Существует несколько протоколов для иммобилизации C. elegans, например используя microfluidic устройства15, агарозы колодки с анестезией16, или микрошарики17. Включение анестезии могут препятствовать торговле людьми события в нейроны15. Четкий недостаток метода microfluidic устройство является подготовка microfluidic устройства не всегда легко. Вместо этого иммобилизация агарозы колодки и микрошарики является удобный и простой способ для выполнения визуализации промежуток времени в C. elegans. Здесь, я описать этот основной протокол иммобилизации C. elegans и визуализировать аксональное транспорта и IFT в естественных условиях в C. elegans. Метод, описанный здесь, по сравнению с другими методами, не требует специального оборудования и намного дешевле и проще выполнить.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ограничение в отношении существующих методов
Метод, описанный здесь оптимизирован для наблюдать быстрый события, такие как аксональное транспорта и IFT. Таким образом иммобилизация более приоритетными чем дольше инкубации. Хотя мы были в состоянии наблюдать за людьми событи…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Автор глубоко спасибо доктор Асако Сугимото (Университет Тохоку) за ее полезные обсуждения. wyIs251 был щедрый подарок от д-ра Кан Шэн (Стэнфордский университет). mnIs17 была предоставлена CGC, которая финансируется Управлением NIH инфраструктуры научно-исследовательских программ (P40 OD010440). Эта работа была поддержана Daiichi Санкё фонд, Наито фонд и фонд науки мозга и JSP-страницы KAKENHI Грант #17 H 05010 и #16 H 06536.
Materials
| Slideglass (76 x 26 mm) | Matsunami | S1111 | |
| Coverglass (22 x 40 mm) | Matsunami | C024401 | |
| Agarose | Wako | 318-01195 | |
| Polystylene microbeads 0.1 micron | Polysciences | #00876 | |
| Heat block | TAITEC | 0063288-000 | CTU-mini |
| Microscope | Olympus | IX-71 | widefield microscope |
| Spinning disk Scanner | Yokogawa | CSU-X1 | spinning disc confocal scanner |
| Digital CCD camera | Hamamatsu Photonics | C10600-10B | ORCA-R2 degital CCD camera |
| Objective lens (x100, NA1.4) | Olympus | UPLSAPO 100XO | |
| Pasteur pipette (5 inch) | IWAKI | IK-PAS-5P | |
| Glass tube (1.5 cm diameter x 10.5 cm) | IWAKI | 9820TST15-105NP | |
| TV9211: wyIs251 | Laboratory of Kang Shen | N/A | |
| OTL11: mnIs17 | Ref. 27, 29 | N/A | SP2101 was backcrossed with wild type for 6 times |
| Stereo microscope | Carl Zeiss | 435064-9000-000 | STEMI 508 |
| Mirror transillumination unit | Carl Zeiss | 435425-9010-000 | |
| platinum wire (0.2 mm) | Nilaco Corporation | m78483501 | |
| 60 mm plastic dish | Falcon | #351007 | |
| Fiji | N/A | N/A | https://fiji.sc/ |
| nematode growth medium (NGM) | 1.7% (w/v) agarose, 50mM NaCl, 0.25% (w/v) Peptone, 1 mM CaCl2, 5 mg/mL Cholesterol, 25 mM KH2PO4, 1 mM MgSO4 |
Referenzen
- Hirokawa, N., Niwa, S., Tanaka, Y. Molecular motors in neurons: transport mechanisms and roles in brain function, development, and disease. Neuron. 68 (4), 610-638 (2010).
- Holzbaur, E. L., Scherer, S. S. Microtubules, axonal transport, and neuropathy. N Engl J Med. 365 (24), 2330-2332 (2011).
- Kamiya, R. Functional diversity of axonemal dyneins as studied in Chlamydomonas mutants. Int Rev Cytol. 219, 115-155 (2002).
- Scholey, J. M. Intraflagellar transport motors in cilia: moving along the cell’s antenna. J Cell Biol. 180 (1), 23-29 (2008).
- Rosenbaum, J. L., Witman, G. B. Intraflagellar transport. Nat Rev Mol Cell Biol. 3 (11), 813-825 (2002).
- Ishikawa, H., Marshall, W. F. Ciliogenesis: building the cell’s antenna. Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (4), 222-234 (2011).
- Niwa, S., et al. Autoinhibition of a Neuronal Kinesin UNC-104/KIF1A Regulates the Size and Density of Synapses. Cell Rep. 16 (8), 2129-2141 (2016).
- Snow, J. J., et al. Two anterograde intraflagellar transport motors cooperate to build sensory cilia on C. elegans neurons. Nat Cell Biol. 6 (11), 1109-1113 (2004).
- Ou, G., Blacque, O. E., Snow, J. J., Leroux, M. R., Scholey, J. M. Functional coordination of intraflagellar transport motors. Nature. 436 (7050), 583-587 (2005).
- Zhou, R., Niwa, S., Homma, N., Takei, Y., Hirokawa, N. KIF26A is an unconventional kinesin and regulates GDNF-Ret signaling in enteric neuronal development. Cell. 139 (4), 802-813 (2009).
- Zhao, C., et al. Charcot-Marie-Tooth disease type 2A caused by mutation in a microtubule motor KIF1Bbeta. Cell. 105 (5), 587-597 (2001).
- Niwa, S., Tanaka, Y., Hirokawa, N. KIF1Bbeta- and KIF1A-mediated axonal transport of presynaptic regulator Rab3 occurs in a GTP-dependent manner through DENN/MADD. Nat Cell Biol. 10 (11), 1269-1279 (2008).
- Zhou, R., Niwa, S., Guillaud, L., Tong, Y., Hirokawa, N. A molecular motor, KIF13A, controls anxiety by transporting the serotonin type 1A receptor. Cell Rep. 3 (2), 509-519 (2013).
- Klassen, M. P., et al. An Arf-like small G protein, ARL-8, promotes the axonal transport of presynaptic cargoes by suppressing vesicle aggregation. Neuron. 66 (5), 710-723 (2010).
- Mondal, S., Ahlawat, S., Koushika, S. P. Simple microfluidic devices for in vivo imaging of C. elegans, Drosophila and zebrafish. J Vis Exp. (67), (2012).
- Chai, Y., et al. Live imaging of cellular dynamics during Caenorhabditis elegans postembryonic development. Nat Protoc. 7 (12), 2090-2102 (2012).
- Kim, E., Sun, L., Gabel, C. V., Fang-Yen, C. Long-term imaging of Caenorhabditis elegans using nanoparticle-mediated immobilization. PLoS One. 8 (1), 53419 (2013).
- Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection. J Vis Exp. (18), (2008).
- Collet, J., Spike, C. A., Lundquist, E. A., Shaw, J. E., Herman, R. K. Analysis of osm-6, a gene that affects sensory cilium structure and sensory neuron function in Caenorhabditis elegans. Genetik. 148 (1), 187-200 (1998).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetik. 77 (1), 71-94 (1974).
- Niwa, S. The nephronophthisis-related gene ift-139 is required for ciliogenesis in Caenorhabditis elegans. Sci Rep. 6, 31544 (2016).
- Maeder, C. I., San-Miguel, A., Wu, E. Y., Lu, H., Shen, K. In vivo neuron-wide analysis of synaptic vesicle precursor trafficking. Traffic. 15 (3), 273-291 (2014).
- Wu, Y. E., Huo, L., Maeder, C. I., Feng, W., Shen, K. The balance between capture and dissociation of presynaptic proteins controls the spatial distribution of synapses. Neuron. 78 (6), 994-1011 (2013).
- Dwyer, N. D., Adler, C. E., Crump, J. G., L’Etoile, N. D., Bargmann, C. I. Polarized dendritic transport and the AP-1 mu1 clathrin adaptor UNC-101 localize odorant receptors to olfactory cilia. Neuron. 31 (2), 277-287 (2001).
- Fang-Yen, C., Gabel, C. V., Samuel, A. D., Bargmann, C. I., Avery, L. Laser microsurgery in Caenorhabditis elegans. Methods Cell Biol. 107, 177-206 (2012).
- Kumar, J., et al. The Caenorhabditis elegans Kinesin-3 motor UNC-104/KIF1A is degraded upon loss of specific binding to cargo. PLoS Genet. 6 (11), 1001200 (2010).
- Zheng, Q., et al. The vesicle protein SAM-4 regulates the processivity of synaptic vesicle transport. PLoS Genet. 10 (10), 1004644 (2014).
- Blacque, O. E., et al. The WD repeat-containing protein IFTA-1 is required for retrograde intraflagellar transport. Mol Biol Cell. 17 (12), 5053-5062 (2006).
- Evans, J. E., et al. Functional modulation of IFT kinesins extends the sensory repertoire of ciliated neurons in Caenorhabditis elegans. J Cell Biol. 172 (5), 663-669 (2006).
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
- Bindels, D. S., et al. mScarlet: a bright monomeric red fluorescent protein for cellular imaging. Nat Methods. 14 (1), 53-56 (2017).
- Prevo, B., Mangeol, P., Oswald, F., Scholey, J. M., Peterman, E. J. Functional differentiation of cooperating kinesin-2 motors orchestrates cargo import and transport in C. elegans cilia. Nat Cell Biol. 17 (12), 1536-1545 (2015).
- Robison, P., et al. Detyrosinated microtubules buckle and bear load in contracting cardiomyocytes. Science. 352 (6284), 0659 (2016).
- Hayashi, S., Okada, Y. Ultrafast superresolution fluorescence imaging with spinning disk confocal microscope optics. Mol Biol Cell. 26 (9), 1743-1751 (2015).
