Un protocollo per il monitoraggio in tempo reale 3D singola particella
Summary
Questo dettagli del protocollo la costruzione e il funzionamento di un microscopio di rilevamento in tempo reale 3D singola particella capace di rilevamento su scala nanometrica fluorescente sonde ad alta velocità diffusiva e tassi di conteggio basso del fotone.
Abstract
Particelle singole tridimensionale in tempo reale (RT-3D-SPT) di rilevamento ha il potenziale per far luce sui processi veloci, 3D in sistemi cellulari. Anche se vari metodi di RT-3D-SPT sono state presentate negli ultimi anni, alta velocità inseguimento 3D diffondente particelle al prezzo di conteggio basso fotone rimane una sfida. Inoltre, configurazioni di RT-3D-SPT sono generalmente complessi e difficili da implementare, limitando la loro diffusa applicazione a problemi biologici. Questo protocollo presenta un sistema di RT-3D-SPT denominato 3D dinamico del fotone localizzazione Tracking (3D-DyPLoT), che permette di monitorare le particelle con diffusiva ad alta velocità (fino a 20 µm2/s) al prezzo di conteggio basso fotone (fino a 10 kHz). 3D-DyPLoT si avvale di un deflettore di elettro-ottica 2D (2D-EOD) e una lente sintonizzabile sfumatura acustica (TAG) all’unità un singolo focalizzato punto dinamicamente in 3D laser. In combinazione con un algoritmo di stima della posizione ottimizzata, 3D-DyPLoT può agganciare di singole particelle con inseguimento ad alta velocità e precisione di localizzazione alta. Grazie alla singola eccitazione e la struttura dei percorsi sola rilevazione, 3D-DyPLoT è robusto e facile da configurare. Questo protocollo viene descritto come costruire 3D-DyPLoT passo per passo. In primo luogo, è descritto il layout ottico. Successivamente, il sistema è calibrato e ottimizzato da raster di scansione una perlina fluorescente di 190 nm con la nanopositioner piezoelettrico. Infine, per dimostrare la capacità di tracciatura in tempo reale 3D, perline fluorescenti di 110 nm sono tracciati in acqua.
Introduction
L’emergere di tecniche avanzate di imaging ha aperto una finestra per vedere la struttura sempre più dettagliata dei fenomeni cellulari, tutta la strada fino al livello molecolare. Metodi quali stocastici ricostruzione ottica microscopia (tempesta)1,2,3, foto-attivata localizzazione microscopia (PALM)4,5,6,7 , strutturato illuminazione microscopia (SIM)8,9,10,11e stimolato emissione svuotamento microscopia (STED)12,13, 14 vanno ben oltre il limite di diffrazione per consegnare un dettaglio senza precedenti nella struttura e nella funzione delle cellule vive. Tuttavia, la comprensione completa di come questi sistemi si comportano richiede informazioni dinamiche, nonché informazioni strutturali. I metodi di Super-risoluzione sopra elencati implicano un compromesso tra la risoluzione spaziale e temporale ad alta risoluzione, limitando la precisione temporale con cui possono essere sondati processi dinamici. Un metodo che fornisce sia alta precisione spaziale e temporale ad alta risoluzione è RT-3D-SPT15,16,17,18,19,20, 21,22,23,24,25,26,27,28,29. Qui, abbiamo una distinzione tra tradizionale 3D-SPT30 e RT-3D-TSS. tradizionale 3D-SPT richiede semplicemente una serie temporale di dati di immagine tridimensionale (che possono essere acquistati o utilizzando un microscopio confocale o un microscopio a epifluorescenza Data la configurazione giusta). In tradizionale 3D-SPT, le coordinate della particella sono determinate dopo la raccolta dei dati di individuazione della particella in ogni serie di immagini e concatenando le posizioni in volumi successivi a creare una traiettoria. Per questi metodi, l’ultima risoluzione temporale è determinata dal tasso di imaging volumetrico. Per microscopi confocali, questo è facilmente sulla scala dei secondi per decine di secondi. Per i metodi epifluorescenza, in cui il percorso ottico viene manipolato in modo che le informazioni di posizione assiale possono essere estratte, la risoluzione temporale è limitata con il tempo di esposizione o della lettura di fotocamera. Questi metodi di epifluorescente sono limitati nella gamma sopra cui assiale informazioni possono essere raccolte, anche se recenti progressi nella fase di Fourier aereo maschere design e ottica adattiva è allungabile questi intervalli di 10 µm o più31,32 , 33 , 34.
Al contrario, RT-3D-SPT non si basa su l’acquisizione di una serie di immagini 3D e trovare particelle dopo il fatto. Invece, informazioni sulla posizione in tempo reale viene estratta tramite rivelatori di singolo punto e feedback viene applicato in modo efficace “bloccare” la particella nel volume focale della lente dell’obiettivo attraverso l’uso di una fase piezoelettrico highspeed. Questo consente la misura continua della posizione della particella limitata solo da quanti fotoni possono essere raccolti. Inoltre, questo metodo consente spettrale interrogatorio della particella che si muove su lunghi tragitti. RT-3D-SPT in effetti funziona simile a una forza-libero ottica trappola per oggetti su scala nanometrica, in cui la particella è continuamente sondata e misurata in tempo reale senza la necessità di alimentazioni grandi laser o ottico le forze. Dato che RT-3D-SPT fornisce un mezzo per l’interrogatorio continuo di oggetti veloce diffusivo (fino a 20 µm2/s)25,29 in tre dimensioni a basso fotone conteggio tariffe20,29, 35, dovrebbe fornire una finestra in processi biologici veloci o transitori come trasporto cargo intracellulare, legame ligando-recettore e la dinamica extracellulare dei virions singolo. Tuttavia, a questo punto, l’applicazione di RT-3D-SPT è stato limitato per la manciata di gruppi di lavoro per far progredire questa tecnologia.
Una barriera è la complessità del layout ottico richieste dai metodi RT-3D-SPT, che sono di vario tipo. Per la maggior parte dei metodi, il feedback ottico è fornito da una fase piezoelettrica. Come il particella fa piccoli movimenti in X, Y, o Z, letture da singolo punto rilevatori vengono convertite in funzioni di errore e alimentato a ad alta velocità per un nanopositioner piezoelettrico, che a sua volta muove il campione per contrastare efficacemente il movimento della particella, bloccandola rispetto alla lente dell’obiettivo. Per misurare piccoli movimenti posizionali in X, Y e Z, o più rivelatori (4 o 5 a seconda dell’implementazione)15,18,21 o punti multipli dell’eccitazione (2-4, il più basso dei quali può essere applicato se una amplificatore di lock-in è utilizzato per estrarre X e posizione Y utilizzando un rotante laser spot)25,28 vengono applicate. La sovrapposizione di questi punti di rilevamento ed emissione multipli rendono difficile allineare e mantenere i sistemi.
Qui, presentiamo un metodo ad alta velocità 3D destinazione-bloccato-SPT con un design ottico semplificato denominato 3D-DyPLoT29. 3D-DyPLoT utilizza un 2D-EOD e un TAG lente36,37,38 per spostare dinamicamente un punto laser focalizzato attraverso il volume focale obiettivo ad un ritmo elevato (50 kHz XY, 70 kHz Z). La posizione di messa a fuoco del laser e l’orario di arrivo del fotone la combinazione consente la posizione della particella 3D di ottenere rapidamente anche a tassi di conteggio basso del fotone. 2D-EOD spinge il fuoco del laser di un cavaliere tour modello39 con un quadrato di 1 x 1 µm nel piano X-Y e la lente di TAG si sposta il fuoco del laser in direzione assiale con una gamma di 2-4 µm. La posizione di particelle 3D si ottiene con una posizione ottimizzata stima algoritmo29,40 in 3D. Il controllo del 3D in modo dinamico movimento laser spot, fotone contando dal fotodiodo a valanga (APD), calcolo della posizione in tempo reale delle particelle, fase piezoelettrico feedback e registrazione dei dati vengono eseguite su un allineamento di cancello programmabile del campo (FPGA).In questo protocollo, descriviamo come costruire un microscopio 3D-DyPLoT passo dopo passo, compreso l’allineamento ottico, calibrazione con particelle fisse e finalmente libero il rilevamento di particelle. Come dimostrazione, perline fluorescenti di 110 nm sono stati monitorati continuamente in acqua per minuti alla volta.
Il metodo qui descritto è la scelta ideale per qualsiasi applicazione dove si desidera monitorare continuamente una sonda fluorescente veloci a bassi livelli di luce, tra cui virus, nanoparticelle e vescicole come gli endosomi. Contrariamente ai metodi precedenti, c’è solo una singola eccitazione e via sola rilevazione, rendendo semplice l’allineamento e la manutenzione. Inoltre, l’area di rilevamento grande consente questo microscopio raccogliere facilmente diffondere rapidamente le particelle, mentre la possibilità di monitorare a livello di segnale basso (fino a 10 kHz) rende questo metodo ideale per applicazioni di basso-luce29.
Protocol
Representative Results
Discussion
Anche se molte varietà di 3D singola particella metodi di monitoraggio sono emerse negli ultimi anni, robusto tracking in tempo reale di diffusione 3D ad alta velocità al prezzo di conteggio basso del fotone con un semplice programma di installazione è ancora una sfida, che limita la sua applicazione al biologico importante problemi. Il metodo 3D-DyPLoT descritto in questo protocollo indirizzi queste sfide in vari modi. In primo luogo, le vie di eccitazione e di rilevamento vengono semplificate notevolmente rispetto a…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato dal National Institute of General Medical Sciences del National Institutes of Health, sotto numero premio R35GM124868 e dalla Duke University.
Materials
| 2D Electro-optic Deflector | ConOptics | M310A | 2 required |
| Power supply for EOD | ConOptics | 412 | Converts FPGA ouput to high voltage for EOD |
| TAG Lens | TAG Optics | TAG 2.0 | Used to deflect laser along axial direction |
| XY piezoelectric nanopositioner | MadCity Labs | Nano-PDQ275HS | Used for moving the sample to lock the particle in the objective focal volume in |
| Z piezoelectric nanoposiitoner | MadCity Labs | Nano-OP65HS | Used to move the objective lens to follow the diffusing particle |
| Micropositioner | MadCity Labs | MicroDrive | Used to coarsely position sample and evaluate |
| Objective Lens | Zeiss | PlanApo | High numerical aperture required for best sensitivity. 100X, 1.49 NA, M27, Zeiss |
| sCMOS camera | PCO | pco.edge 4.2 | Used to monitor the particle's position |
| APD | Excelitas | SPCM-ARQH-15 | Lower dark counts beneficial |
| Field programmable gate array | National Instruments | NI-7852r | |
| Software | National Instruments | LabVIEW | |
| Tracking excitation laser | JDSU | FCD488-30 | |
| Lens | ThorLabs | AC254-150-A-ML | L1 |
| Lens | ThorLabs | AC254-200-A-ML | L2 |
| Pinhole | ThorLabs | P75S | PH |
| Glan-Thompson Polarizer | ThorLabs | GTH5-A | GT |
| Half-wave plate | ThorLabs | WPH05M-488 | WP |
| Lens | ThorLabs | AC254-75-A-ML | L3 |
| Lens | ThorLabs | AC254-250-A-ML | L4 |
| Lens | ThorLabs | AC254-200-A-ML | L5 |
| Lens | ThorLabs | AC254-200-A-ML | L6 |
| Dichroic Mirror | Chroma | ZT405/488/561/640rpc | DC |
| Fluorescence Emission Filter | Chroma | D535/40m | F |
| 10/90 beamsplitter | Chroma | 21012 | BS |
| PBS | Sigma | D8537 | |
| 190 nm fluorescent nanoparticles | Bangs laboratories | FC02F/9942 | |
| 110 nm fluorescent nanoparticles | Bangs laboratories | FC02F/10617 | |
| Coverslip | Fisher Scientific | 12-545A | |
| Powermeter | Thorlabs | PM100D | |
| CMOS | Thorlabs | DCC1545M | |
| Iris | Thorlabs | SM1D12D | |
| Microscope | Mad City Labs | RM21 |
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