Un protocolo para el seguimiento en tiempo real 3D sola partícula
Summary
Datos de este protocolo la construcción y operación de un microscopio de seguimiento en tiempo real 3D sola partícula capaz de seguimiento nanoescala fluorescente puntas de prueba a altas velocidades difusivos y tasas de conteo de fotones baja.
Abstract
Sola partícula tridimensional en tiempo real (RT-3D-SPT) de seguimiento tiene el potencial de arrojar luz sobre procesos rápidos y 3D en sistemas celulares. Aunque varios métodos de RT-3D-SPT han presentado en los últimos años, seguimiento de alta velocidad 3D difundiendo partículas en tasas de conteo de fotones baja sigue siendo un desafío. Por otra parte, configuraciones RT-3D-SPT son generalmente complejas y difíciles de implementar, limitar su aplicación generalizada a problemas biológicos. Este protocolo presenta un sistema RT-3D-SPT llamado 3D dinámica del fotón localización seguimiento (3D-DyPLoT), que puede rastrear partículas con difusores de alta velocidad (hasta 20 μm/s2) en tasas de conteo de fotones bajas (hasta 10 kHz). 3D-DyPLoT emplea un deflector de electro-óptico 2D (2D-EOD) y una lente de gradiente acústico armonioso (etiqueta) para conducir un único centrado láser punto dinámicamente en 3D. Combinado con un algoritmo de estimación de posición optimizada, 3D-DyPLoT puede trabar sobre partículas individuales con seguimiento de alta velocidad y precisión de localización alta. Debido a la excitación individual y diseño de ruta solo detección, 3D-DyPLoT es robusto y fácil de configurar. Este protocolo describe cómo construir paso a paso de 3D-DyPLoT. En primer lugar, se describe el diseño óptico. A continuación, el sistema es calibrado y optimizado por trama exploración una tira fluorescente de 190 nm con el nanopositioner piezoeléctrico. Finalmente, para demostrar la capacidad de seguimiento de tiempo real 3D, perlas fluorescentes de 110 nm se realiza un seguimiento en el agua.
Introduction
La aparición de técnicas de imagen avanzadas ha abierto una ventana para ver la estructura cada vez más detallada de los fenómenos celulares, hasta el nivel molecular. Métodos tales como la reconstrucción óptica estocástica (tormenta) la microscopia1,2,3, Foto-activado localización microscopia (Palma)4,5,6,7 , estructurado iluminación microscopia (SIM)8,9,10,11y estimuló la emisión (STED) la microscopia de agotamiento de12,13, 14 han ido mucho más allá del límite de difracción para entregar de detalle sin precedentes en la estructura y función de células vivas. Sin embargo, el completo entendimiento de cómo estos sistemas se comportan requiere información dinámica así como la información estructural. Los métodos de resolución súper mencionados implican una relación inversa entre la resolución espacial y resolución temporal, limitando la precisión temporal con la que pueden ser explorados procesos dinámicos. Un método que proporciona alta precisión espacial y resolución temporal es RT-3D-SPT15,16,17,18,19,20, 21,22,23,24,25,26,27,28,29. Aquí, dibujamos una distinción entre tradicionales 3D-SPT30 y RT-3D-designado tradicional SPT 3D simplemente requiere de una serie temporal de datos de imagen tridimensional (que se pueden adquirir ya sea mediante un microscopio confocal o un microscopio de epifluorescencia Dada la configuración correcta). En tradicional 3D-SPT, las coordenadas de la partícula se determinan después de la recolección de datos de localización de la partícula en cada pila imagen y concatenación de las ubicaciones en sucesivos volúmenes para crear una trayectoria. Estos métodos, la máxima resolución temporal está determinada por la tasa de proyección de imagen volumétrica. Para microscopios confocales, es fácilmente en la escala de segundos a decenas de segundos. Métodos de epifluorescencia, en donde el camino óptico es manipulado para que la información de localización axial puede ser extraída, la resolución temporal está limitada por el tiempo de exposición o lectura de cámara. Estos métodos epifluorescente están limitados en la gama que puede recopilarse información axial, aunque recientes avances en la fase del plano de Fourier máscaras diseño y óptica adaptativa está ampliando estas gamas a 10 μm o más31,32 , 33 , 34.
Por el contrario, RT-3D-SPT no se basa en adquirir una pila de imágenes 3D y la búsqueda de las partículas después del hecho. Por el contrario, se extrae información de ubicación en tiempo real a través de detectores de punto único y regeneración se aplica a efectivamente “bloquear” la partícula en el volumen focal de la lente del objetivo mediante el uso de una etapa piezoeléctrico de alta velocidad. Esto permite la medición continua de la posición de la partícula limitada sólo por cuántos fotones se pueden recoger. Además, este método permite interrogatorio espectral de la partícula que se mueve en gamas largas. RT-3D-SPT en efecto funciona similar a una trampa óptica fuerza-libre para objetos de escala nanométrica, donde la partícula continuamente es explorada y medida en tiempo real sin necesidad de poderes grandes láser u óptica de las fuerzas. Dado que RT-3D-SPT constituye una forma de interrogatorio continuo de objetos rápida difusión (hasta 20 μm2/s)25,29 en tres dimensiones en el fotón bajo cuenta tarifas20,29, 35, debe proporcionar una ventana en procesos biológicos rápidos o transitorios como transporte de carga intracelular, Unión ligando-receptor y la dinámica extracelular de viriones individuales. Sin embargo, a este punto, la aplicación de la RT-3D-SPT se ha limitado a ese puñado de grupos de trabajo para avanzar en esta tecnología.
Una barrera es la complejidad del diseño óptico requerida métodos de RT-3D-SPT, que son muy variados. Para la mayoría de los métodos, la retroalimentación óptica proporciona una etapa piezoeléctrica. Como los partícula hace pequeños movimientos en X, Y, o Z, lecturas de punto único detectores están convertidos a funciones de error y en alta velocidad a un nanopositioner piezoeléctrico, que en su vez mueve la muestra para contrarrestar el movimiento de la partícula, con eficacia bloqueo en su lugar con respecto a la lente del objetivo. Para medir pequeños movimientos posicionales en X, Y y Z, múltiples detectores (4 o 5 dependiendo de la implementación)15,18,21 o múltiples puntos de excitación (2-4, el menor de los cuales se puede aplicar si una amplificador de bloqueo se utiliza para extraer X y posición Y mediante una rotación láser spot) se aplican25,28 . La superposición de estas múltiples puntos de detección y emisión de hacer los sistemas difíciles de alinear y mantener.
Adjunto, presentamos un método de alta velocidad 3D objetivo bloqueado-SPT con un diseño óptico simplificado llamado 3D-DyPLoT29. 3D-DyPLoT utiliza una EOD 2D y una etiqueta lente36,37,38 para mover dinámicamente un punto láser enfocado a través del volumen focal objetivo a una velocidad alta (50 kHz XY, Z de 70 kHz). Combinando la posición de foco del láser y el tiempo de llegada de fotones permite posición 3D del objeto a obtenerse rápidamente incluso en tasas de conteo de fotones baja. 2D-EOD conduce el enfoque láser en visita patrón39 con un tamaño de cuadrado de 1 x 1 μm en el plano X-Y de un caballero y el objetivo de la etiqueta mueve el enfoque láser en dirección axial con una gama de 2-4 μm. La posición de la partícula 3D se obtiene con una posición optimizada estimación algoritmo29,40 en 3D. El control del 3D dinámicamente móviles laser punto, fotón contando desde el fotodiodo de avalancha (APD), cálculo de posición de partículas en tiempo real, piezoeléctrico etapa retroalimentación y registro de datos se realizan en un arreglo de compuertas programables en campo (FPGA).En este protocolo, se describe cómo construir un microscopio 3D-DyPLoT paso a paso, incluyendo alineación óptica, calibración con partículas fijas y finalmente libre seguimiento de partículas. Como demostración, perlas fluorescentes de 110 nm fueron seguidos continuamente en el agua durante minutos a la vez.
El método descrito en este documento es una opción ideal para cualquier aplicación donde se desea monitorear continuamente una sonda fluorescente rápidos en niveles de luz bajos, incluyendo virus, nanopartículas y vesículas de endosomas. En contraste con los métodos anteriores, existe sólo una única excitación y detección solo camino, hacer alineación y mantenimiento sencillo. Además, el área de detección grande permite este microscopio fácilmente recoger rápidamente difundiendo partículas, mientras que la capacidad de seguimiento de nivel de señal baja (hasta 10 kHz) hace este método ideal para aplicaciones de baja luz29.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aunque muchas variedades de 3D sola partícula seguimiento métodos han surgido en los últimos años, robusto rastreo en tiempo real de la difusión de 3D de alta velocidad en tasas de conteo de fotones bajo con una configuración simple es todavía un reto, que limita su aplicación a la biológica importante problemas. El método 3D-DyPLoT había descrito en esta dirección estos retos en varios sentidos. En primer lugar, las vías de excitación y detección se simplifican considerablemente en comparación con otras …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por el Instituto Nacional de General médica Ciencias de los institutos nacionales de salud con el número de concesión R35GM124868 y por la Universidad de Duke.
Materials
| 2D Electro-optic Deflector | ConOptics | M310A | 2 required |
| Power supply for EOD | ConOptics | 412 | Converts FPGA ouput to high voltage for EOD |
| TAG Lens | TAG Optics | TAG 2.0 | Used to deflect laser along axial direction |
| XY piezoelectric nanopositioner | MadCity Labs | Nano-PDQ275HS | Used for moving the sample to lock the particle in the objective focal volume in |
| Z piezoelectric nanoposiitoner | MadCity Labs | Nano-OP65HS | Used to move the objective lens to follow the diffusing particle |
| Micropositioner | MadCity Labs | MicroDrive | Used to coarsely position sample and evaluate |
| Objective Lens | Zeiss | PlanApo | High numerical aperture required for best sensitivity. 100X, 1.49 NA, M27, Zeiss |
| sCMOS camera | PCO | pco.edge 4.2 | Used to monitor the particle's position |
| APD | Excelitas | SPCM-ARQH-15 | Lower dark counts beneficial |
| Field programmable gate array | National Instruments | NI-7852r | |
| Software | National Instruments | LabVIEW | |
| Tracking excitation laser | JDSU | FCD488-30 | |
| Lens | ThorLabs | AC254-150-A-ML | L1 |
| Lens | ThorLabs | AC254-200-A-ML | L2 |
| Pinhole | ThorLabs | P75S | PH |
| Glan-Thompson Polarizer | ThorLabs | GTH5-A | GT |
| Half-wave plate | ThorLabs | WPH05M-488 | WP |
| Lens | ThorLabs | AC254-75-A-ML | L3 |
| Lens | ThorLabs | AC254-250-A-ML | L4 |
| Lens | ThorLabs | AC254-200-A-ML | L5 |
| Lens | ThorLabs | AC254-200-A-ML | L6 |
| Dichroic Mirror | Chroma | ZT405/488/561/640rpc | DC |
| Fluorescence Emission Filter | Chroma | D535/40m | F |
| 10/90 beamsplitter | Chroma | 21012 | BS |
| PBS | Sigma | D8537 | |
| 190 nm fluorescent nanoparticles | Bangs laboratories | FC02F/9942 | |
| 110 nm fluorescent nanoparticles | Bangs laboratories | FC02F/10617 | |
| Coverslip | Fisher Scientific | 12-545A | |
| Powermeter | Thorlabs | PM100D | |
| CMOS | Thorlabs | DCC1545M | |
| Iris | Thorlabs | SM1D12D | |
| Microscope | Mad City Labs | RM21 |
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