衰减全反射红外光谱和多变量数据分析检测和定量水红血球中恶性疟原虫
Summary
在这里, 我们提出了一个协议, 检测和定量恶性疟原虫在受感染的水红血球使用衰减总反射红外光谱仪和多变量数据分析。
Abstract
我们演示了一种利用简单的台式衰减全反射傅里叶变换红外光谱仪与多元数据分析 (mvda)。对 10%的寄生虫血症环状寄生虫进行了 3d7 p. 恶性疟原虫培养, 用于穗生分离的红细胞, 形成0–1% 之间的稀释序列。每个样品的10μl 被放置在 atr 金刚石窗口的中心, 以获得光谱。对样本数据进行了处理, 提高了信噪比, 消除了水的贡献, 然后应用二阶导数来求解光谱特征。然后使用两种类型的 mvda 对数据进行分析: 第一种主成分分析 (pca) 用于确定任何异常值, 然后是偏最小二乘回归 (pls-r) 来建立量化模型。
Introduction
疟疾是我们时代最具破坏性的疾病之一;在流行地区, 一半以上的人口生活在危险之中, 这给 1、2、3、4 的穷人带来了不成比例的负担。问题的很大一部分是无症状携带者和早期患者, 他们是蚊虫媒介5的宿主,在雨季造成感染激增, 并使其在社区持续存在。疟疾是由五种疟原虫引起的, 其中最致命的是恶性疟原虫, 它导致了这种疾病的最严重的形式2。
目前, 疟疾诊断技术还不尽如人意。光学显微镜, 目前的黄金标准, 只能检测62-88 寄生虫μμl 取决于所使用的方法6。此外, 由于强度和所需技能较高, 在许多地区, 显微镜诊断和 gt;50% 的病例, 特别是2级低寄生虫血症病例,这可直接归因于该地区缺乏资源, 其结果是:滥用抗疟疾药物。其他两种主要诊断方法是利用抗体进行检测的快速诊断测试 (rdt) 和聚合酶链反应 (pcr) 检测, 后者区分和量化 dna 中的寄生虫。目前, rdt 只能检测到至少100种寄生虫的恶性疟原虫和vivax,导致这种疾病的罕见形式得不到治疗。7.,8相反, pcr 检测在血液的 0.04-5-μμμμl 的敏感性下, 对不同种类的疟原虫进行了鉴别和量化。然而, 它需要昂贵的试剂、设备和技术技能, 因此不适合现场应用。
高度敏感、可靠和经济实惠的技术对于缩短诊断时间, 从而改善患者结果并使疾病消除成为可能至关重要。衰减全反射傅里叶变换 (atr-ftir) 光谱为这一问题提供了一个潜在的解决方案。先前的研究表明, 有可能检测和量化甲醇固定血膜中的恶性疟原虫, 达到 lt;1 血液寄生虫 (& lt;0.0002% 寄生虫血症)9的检出限, 这与 pcr 方法相当。最近的研究表明, 有可能检测和量化水样中的寄生虫, 从而消除固定步骤。然而, 为了取得最佳结果, 需要考虑水汽、光谱噪声和数据处理等因素.
该协议旨在向新用户展示如何获取 atr-ftir 光谱, 并为从红血球 (rbc) 水溶液样本10中检测恶性疟原虫建立回归模型。
Protocol
Representative Results
Discussion
pls-r 模型是一种受监督的多变量方法, 它查找预测变量 x (此处为每个波数的吸收率) 和连续变量 y (此处为寄生虫血症水平) 之间的线性关系, y = bx + e。简而言之, 该模型结合 x 中的变量来创建一组新的潜在变量 (lv), 以捕获与 y 相关的 x 上的方差, 并计算一个回归向量 (b), 该向量乘以一个新的频谱结果, 从而导致 y 值的估计。模型的强度可以从两个值中提取: r2 值和交叉验证的根均方误差 (rmse…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
澳大利亚研究理事会 (未来研究金 ft120100926 至 brw)、澳大利亚国家卫生和医学研究理事会 (jgb 的方案赠款和高级研究金) 向提交人提供了资金;早期职业研究金向伯内特研究所提供的研究所基础设施支助计划赠款), 以及维多利亚州政府向伯内特研究所提供的业务基础设施支助赠款。我们感谢芬雷·尚克斯先生的有力支持。
Materials
| Donor blood | – | – | Must be collected by a trained medical practitioner |
| Stock blood | Australian Red Cross` | – | |
| 3D7 Plasmodium falciparum | The Burnet Institute | – | Laboratory strain wild type equivalent |
| RPMI-1640 media with L-hepes without Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | R6504 | |
| Albumax (Gibco) | Thermofisher | E003000PJ | Aliquot into 50 mL falcon tubes and store in freezer |
| Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S5761 | |
| Giemsa Stain | Sigma Aldrich | 48900 | |
| Sorbitol | Sigma Aldrich | S1876 | Must be filtered before use in culture |
| Blood collection tubes (Vacutainers) | Becton, Dickonson and Company | 367671 | |
| Immersion Oil | Thermofisher | M3004 | |
| 50 mL culture dishes | Falcon | 353025 | |
| 25mL pipette tips | Falcon | 357515 | |
| 10mL pipette tips | Falcon | 357530 | |
| Microscope Slides | Sigma Aldrich | S8902 | |
| Centrifuge tubes 50 mL | Sigma Aldrich | T2318 | |
| Automated pipette controller | Integra-biosciences | 155 015 | |
| Sorvall Legend X1R Centrifuge | Thermofisher | 75004260 | |
| Forma™ 310 Direct Heat CO2 Incubators | Thermofisher | 310TS | |
| Nikon Eclipse E-100 Binocular Microscope | Nikon Instruments | E100_2CE-MRTK-1 | When purchasing ensure that the 100x lens is an oil immersion lens |
| Bruker Alpha Ft-IR Spectrometer with ATR Quick Snap Attachment | Bruker | 9308-3700 | Be sure to request "Eco-ATR" attachment when purchasing |
| Matlab | Mathworks Inc | Multivariate data analysis software | |
| The Unscrambler X | CAMO | Multivariate data analysis software | |
| PLS-Toolbox | Mathworks, Inc. | GUI for Matlab |
Referenzen
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