Erkennung und Quantifizierung von Plasmodium Falciparum in wässrigen roten Blutkörperchen durch gedämpft totale Reflexion Infrarotspektroskopie und Multivariate Datenanalyse
Summary
Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für die Erkennung und Quantifizierung von Plasmodium Falciparum infizierten wässrigen roten Blutkörperchen mit einem abgeschwächten Totalreflexion Infrarot-Spektrometer und multivariate Datenanalyse.
Abstract
Wir zeigen eine Methode zur Quantifizierung und Nachweis von Parasiten in wässrigen roten Blutkörperchen (Erythrozyten) mithilfe einer einfachen Benchtop abgeschwächt totale Reflexion Fourier transformieren (ATR-FTIR) Infrarotspektrometer in Verbindung mit Multivariate Datenanalyse ( MVDA). 3 7 p. Falciparum wurden kultiviert, 10 % Parasitemia Ring Bühne Parasiten und verwendet frische Spender isoliert Erythrozyten erstellen eine Verdünnung Serie zwischen 0 – 1 Spike %. 10 µL jeder Probe wurden aufgestellt, auf die Mitte des Fensters ATR Diamant, das Spektrum zu erwerben. Die Beispieldaten wurde behandelt, um das Signal-Rausch-Verhältnis zu verbessern und den Beitrag des Wassers zu entfernen, und dann die zweite Ableitung wurde angewandt, um die spektrale Eigenschaften zu lösen. Die Daten wurden dann mit zwei Arten von MVDA analysiert: erste Principal Komponente Analysis (PCA), Ausreißer und dann Partial Least Squares Regression (PLS-R) für die Quantifizierung Modellerstellung zu bestimmen.
Introduction
Malaria zählt zu den verheerendsten Krankheiten unserer Zeit; mehr als die Hälfte die Bevölkerung lebt in endemischen Gebieten gefährdet und es unverhältnismäßig belastet die Armen1,2,3,4. Ein großer Teil des Problems ist die asymptomatische Träger und frühen Stadium-Patienten, die als Reservoir für Moskito Vektoren5, Handeln verursacht Spikes von Infektion während der Regenzeit und in den Gemeinden bestehen bleiben soll, so dass. Malaria wird durch fünf Plasmodium -Parasiten, verursacht die tödlichste von denen p. Falciparum ist die schwerste Form der Krankheit2verursacht.
Derzeit sind Techniken für die Diagnose von Malaria weniger als perfekt. Optische Mikroskopie, der derzeitige Goldstandard erkennt nur 62-88 Parasiten/µL je nach der verwendeten Methode6. Darüber hinaus aufgrund der Intensität und hohen Geschick erforderlich, in vielen Regionen Mikroskopie Fehldiagnosen > 50 % der Fälle, vor allem solche mit niedrigem Parasitaemia Ebenen2, in dem der Mangel an Ressourcen im Bereich und führt direkt zugeordnet werden können der Missbrauch von Anti-Malaria-Medikamenten. Die anderen 2 wichtigsten diagnostischen Methoden sind Schnelltests (RDTs), die Antikörper für die Erkennung und die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Assays, die Diskriminierung und Parasiten von DNA quantifizieren zu nutzen. RDTs können derzeit nur zur Erkennung von p. Falciparum und p. Vivax von mindestens 100 Parasiten/µL Blut was in selteneren Formen der Krankheit nicht behandelt wird. 7 , 8 dagegen PCR-Assays diskriminieren und quantifizieren, verschiedene Arten von Plasmodium bei einer Empfindlichkeit von 0,0004-5 Parasiten/µL Blut. Aber es erfordert teure Reagenzien, Ausrüstung und technisches Geschick und so eignet sich nicht für den Feldeinsatz.
Eine höchst sensible, zuverlässige und erschwingliche Technik unbedingt verbessern Diagnose Mal Behandlungsergebnisse zu verbessern, und die Beseitigung der Krankheit ermöglichen. Abgeschwächte totale Reflexion Fourier Transform (ATR-FTIR) Spektroskopie bietet eine mögliche Lösung für dieses Problem. Bisherigen Arbeit hat gezeigt, dass war es möglich zu erkennen und zu quantifizieren, p. Falciparum in Methanol fixiert Blut Filme erreichen die Nachweisgrenzen der < 1 Parasit/µL Blut (< 0,0002 % Parasitemia)9, das PCR-Verfahren vergleichbar ist. Neuere Studien haben gezeigt, dass es möglich ist zu erkennen und zu quantifizieren Parasiten in wässrigen Proben und eliminieren die Fixierung Schritt. Allerdings müssen Faktoren wie Wasserdampf, spektrale Rauschen und Datenverarbeitung für optimale Ergebnisse10berücksichtigt werden.
Dieses Protokoll zielt darauf ab, neue Benutzer zeigen, wie Sie erwerben FTIR-ATR Spektren und bereiten ein Regressionsmodell für die Erkennung von p. Falciparum von wässrigen Erythrozyten (RBC) Proben10.
Protocol
Representative Results
Discussion
PLS-R-Modell ist eine betreute multivariate Methode, die findet eine lineare Beziehung, Y = bX + E, zwischen den prädiktiven Variablen X (hier: der Extinktion bei einzelnen Wellenzahl) und eine kontinuierliche Variable Y (hier: der Parasitemia-Ebene). Kurz gesagt, das Modell verbindet die Variablen X, um einen neuen Satz von latenten Variablen (LVs) erstellen, die die Varianz auf X korreliert mit Y zu erfassen, und einen Regression Vektor (b) berechnet, die ein neues Spektrum Ergebnisse bei der Schätzung der y-Wert mul…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Zu den Autoren wurde gefördert vom Australian Research Council (Zukunft Fellowship FT120100926, BRW), National Health and Medical Research Council of Australia (Programm Grant und Senior Research Fellowship zu JGB; Frühe Karriere Stipendien JSR; Infrastruktur für die Forschung Institute Support Scheme Grant Burnet Institut), und die Victorian State Regierung betrieblichen Infrastruktur unterstützen Grant Burnet Institut. Wir bestätigen Herrn Finlay Shanks für instrumentale Unterstützung.
Materials
| Donor blood | – | – | Must be collected by a trained medical practitioner |
| Stock blood | Australian Red Cross` | – | |
| 3D7 Plasmodium falciparum | The Burnet Institute | – | Laboratory strain wild type equivalent |
| RPMI-1640 media with L-hepes without Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | R6504 | |
| Albumax (Gibco) | Thermofisher | E003000PJ | Aliquot into 50 mL falcon tubes and store in freezer |
| Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S5761 | |
| Giemsa Stain | Sigma Aldrich | 48900 | |
| Sorbitol | Sigma Aldrich | S1876 | Must be filtered before use in culture |
| Blood collection tubes (Vacutainers) | Becton, Dickonson and Company | 367671 | |
| Immersion Oil | Thermofisher | M3004 | |
| 50 mL culture dishes | Falcon | 353025 | |
| 25mL pipette tips | Falcon | 357515 | |
| 10mL pipette tips | Falcon | 357530 | |
| Microscope Slides | Sigma Aldrich | S8902 | |
| Centrifuge tubes 50 mL | Sigma Aldrich | T2318 | |
| Automated pipette controller | Integra-biosciences | 155 015 | |
| Sorvall Legend X1R Centrifuge | Thermofisher | 75004260 | |
| Forma™ 310 Direct Heat CO2 Incubators | Thermofisher | 310TS | |
| Nikon Eclipse E-100 Binocular Microscope | Nikon Instruments | E100_2CE-MRTK-1 | When purchasing ensure that the 100x lens is an oil immersion lens |
| Bruker Alpha Ft-IR Spectrometer with ATR Quick Snap Attachment | Bruker | 9308-3700 | Be sure to request "Eco-ATR" attachment when purchasing |
| Matlab | Mathworks Inc | Multivariate data analysis software | |
| The Unscrambler X | CAMO | Multivariate data analysis software | |
| PLS-Toolbox | Mathworks, Inc. | GUI for Matlab |
Referenzen
- Hommel, M., Gilles, H., Collier, L., Balows, A., Sussman, M. Chapter 20. Topley & Wilson’s Microbiology and Microbial Infections. Vol. 5 Parasitology. , 361 (1998).
- World Health Organization. . World Malaria Report 2016. , (2016).
- Rogers, W., Murray, P., Baron, E., Pflaller, M., Tenover, F., Yolken, R. Chapter 105. Manual of Clinical Microbiology. , 1355 (1999).
- White, N. J. Chapter 9. Manson’s Tropical Infectious Diseases. 23, 532-600 (2014).
- Lindblade, K. A., Steinhardt, L., Samuels, A., Kachur, S. P., Slutsker, L. The silent threat: asymptomatic parasitemia and malaria transmission. Expert Rev Anti Infect Ther. 11 (6), 623-639 (2013).
- Hanscheid, T., Grobusch, M. How useful is PCR in the diagnosis of malaria. Trends Parasitol. 18 (9), 395-398 (2002).
- Joanny, F., Löhr, S. J., Engleitner, T., Lell, B., Mordmüller, B. Limit of blank and limit of detection of Plasmodium falciparum thick blood smear microscopy in a routine setting in Central Africa. Malar J. 13 (1), 234-241 (2014).
- World Health Organisation. . Malaria Rapid Diagnostic Test Performance: results of WHO product testing of malaria RDTs: round 6 (2014-2015). , (2014).
- Khoshmanesh, A., et al. Detection and quantification of early-stage malaria parasites in laboratory infected erythrocytes by attenuated total reflectance infrared spectroscopy and multivariate analysis. Anal Chem. 86, 4379-4386 (2014).
- Martin, M., et al. The effect of common anticoagulants in detection and quantification of malaria parasitemia in human red blood cells by ATR-FTIR spectroscopy. Anal. 142 (8), 1192-1199 (2017).
- Fabian, H., Mäntele, W. . Handbook of Vibrational Spectroscopy. , (2006).
- Whelan, D., et al. Monitoring the reversible B to A-like transition of DNA in eukaryotic cells using Fourier transform infrared spectroscoptMonitoring the reversible B to A-like transition of DNA in eukaryotic cells using Fourier transform infrared spectroscopy. Nucleic Acid Res. 39 (13), 5439-5448 (2011).
- Wood, B. The importance of hydration and DNA conformation in interpreting infrared spectra of cells and tissues. Chem Soc Rev. 45, 1980-1998 (1980).
- Plyler, E. K. Infrared spectra of methanol, ethanol, and rn-propanol. J Res Natl Bur Stand. 48 (4), (1952).
