Behandeling van Monosynaptic verbindingen in Drosophila met behulp van resistente tetrodotoxine natrium kanalen
Summary
Dit artikel biedt een methode om te testen de monosynaptic verbindingen tussen neuronen door tetrodotoxine en het tetrodotoxine-resistente natrium-kanaal, NaChBac.
Abstract
Hier, wordt een nieuwe techniek genoemd Tetrotoxin (TTX) Engineered weerstand voor indringende Synapses (kerken) toegepast om te testen voor monosynaptic verbindingen tussen neuronen van de doelgroep. De methode is gebaseerd op co uitdrukking van een transgene activator met het tetrodotoxine-resistente natrium-kanaal, NaChBac, in een specifieke presynaptische neuron. Verbindingen met vermeende post synaptic partners worden bepaald door geheel-cel opnames in aanwezigheid van de TTX, die blokken van elektrische activiteit in de neuronen die niet NaChBac doen uitdrukken. Deze aanpak kan worden aangepast voor het werken met elke activator of calcium imaging als een verslaggever van verbindingen. KERKEN wordt toegevoegd aan de groeiende verzameling van hulpprogramma’s voor het bepalen van de connectiviteit binnen netwerken. KERKEN is echter uniek in die zin dat zij ook betrouwbaar bulk of volume transmissie en spill-over transmissie verslag.
Introduction
Een belangrijk doel van de neurowetenschappen is om de verbindingen tussen neuronen te begrijpen hoe informatie stroomt door schakelingen in kaart. Talrijke benaderingen en middelen zijn beschikbaar om te testen voor functionele verbindingen tussen neuronen in een waaier van model systemen1,2gekomen. Voor het genereren van de meest nauwkeurige schakelschema’s met behulp van electrofysiologie, is het belangrijk om op te lossen of waargenomen verbindingen tussen twee cellen directe en monosynaptic versus indirecte en polysynaptic zijn. Een gouden standaard voor het maken van dit onderscheid in zoogdieren neuronen is voor het meten van de latentie tussen enkele action potentials in de presynaptische cellen en het begin van excitatory postsynaptisch stromingen (EPSCs) in het tweede neuron. Monosynaptic verbindingen moeten korte latencies voor een paar milliseconden en lage variabiliteit3. Deze aanpak kan worden gecompliceerd in ongewervelde neuronen omdat synapsen op in hun dendrites ver van de somatische opname site treedt, veroorzaakt door vertragingen in de opsporing als gevolg van lange electrotonic afstanden tussen postsynaptisch conductances en de opname elektrode. Dergelijke vertragingen kunnen leiden tot dubbelzinnigheid over poly-versus monosynaptic bijdragen. Bovendien, kleine synaptic gebeurtenissen kan verval alvorens de site somatische opnames en rijden sterker presynaptische activiteit, dreigt te werven van polysynaptic evenementen.
Diverse technieken zijn ontwikkeld om te testen voor monosynaptic verbindingen in ongewervelden. Een benadering gebruikt hoge divalente kationen oplossingen (Hi-Di) met overtollige Mg++ en Ca++. Deze oplossing blokkeert polysynaptic verbindingen op vermindering release waarschijnlijkheid en toenemende actiepotentiaal drempel om de gunst van de detectie van monosynaptic input4,5. Bepaling van de precieze verhouding van Mg++ aan Ca++ vereist, echter, is niet triviaal en zelfs bescheiden stimulatie6polysynaptic bijdragen kunnen aanhouden. Een alternatieve benadering genaamd GFP reconstitutie in Synaptic Partners (greep) maakt gebruik van de nabijheid tussen pre-en postsynaptisch membraan gevonden op synapsen afleiden een monosynaptic verbinding 7. Hier, een onderdeel van de groen fluorescente proteïne (GFP) wordt uitgedrukt in een neuron en de aanvullende fragment van het molecuul wordt uitgedrukt in een vermeende postsynaptisch partner. De aanwezigheid van fluorescentie geeft aan dat de twee neuronen zijn genoeg dicht bij toestaan reconstitutie van het GFP-molecuul en impliceert het bestaan van een synaps. GREEP kunt melden synapsen ten onrechte, hoewel, als twee cellen hebben nauw apposed membranen, zoals in een zenuw of fascicle. Varianten van greep elimineren deze valse positieven door het binden van de presynaptische fragment van GFP rechtstreeks naar synaptobrevin, waardoor de reconstitutie alleen op actieve synapsen8. Terwijl greep en zijn varianten instrumentaal zijn bij het bepalen van de functionele connectiviteit in de Drosophila CNS, kunnen sommige verbindingen niet zichtbaar worden gemaakt door greep als de afstanden tussen de pre- en postsynaptisch partners is relatief groot. Dit is vooral relevant bij de beoordeling van volume transmissie neuromodulatie9 of10remming GABAergic zijn gekoppeld.
Hier blijkt een complementaire en nieuwe techniek voor het testen van directe monosynaptic verbindingen in de Drosophila CNS. Deze methode, genaamd tetrodotoxine Engineered weerstand voor indringende Synapses (kerken), werkt door co uitdrukking van de tetrodotoxine (TTX)-resistente natrium-kanaal, NaChBac en een optogenetic activator in een presynaptische cel tijdens het opnemen van vermeende postsynaptisch partners9. In aanwezigheid van de TTX, wordt alle actiepotentiaal-gemedieerde activiteit onderdrukt in cellen dan die uiting van NaChBac. Het NaChBac kanaal herstelt selectief prikkelbaarheid in de gerichte presynaptische cel(len), synaptische transmissie licht-opgeroepen het toelaat. Deze methode maakt sterke activering van de presynaptische neuronen, zodanig dat verbindingen postsynaptically kunnen worden opgelost door somatische opname terwijl het verminderen van de kans op polysynaptic schakelingen te werven. Nog belangrijker is, is deze techniek maakt de studie van volume transmissie en onthult de verspreiding van zender vrijgelaten uit een enkel neuron in een circuit. Bovendien kan de kerken de chemische aard van de verbinding via conventionele farmacologie onthullen. KERKEN is geschikt voor gebruik in elk modelsysteem waarmee de transgene uitdrukking van TTX-ongevoelig natrium kanalen.
Protocol
Representative Results
Discussion
KERKEN analyse complimenten huidige technieken die worden gebruikt voor circuit kraken doordat de detectie van synapsen tussen geïdentificeerde neuronen. In het bijzonder blijkt de aanpak monosynaptic verbindingen door in grote lijnen silencing actie potentials met TTX wijl restoring prikkelbaarheid in een select aantal neuronen met de TTX-ongevoelig natrium-kanaal NaChBac. Synaptic release wordt opgewekt door stimulatie van de optogenetic terwijl postsynaptisch gebeurtenissen worden gecontroleerd met de opnames van de …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We zouden graag bedanken Joshua Singer, Jonathan Schenk, evenals nadenkende reviewers voor opmerkingen op het manuscript. Wij zouden ook willen bedanken Ben White en Harold Zakon voor discussies over de techniek. Jonathan Schenk de gegevens heeft verschaft voor figuur 3A. Dit werk werd gesteund door een subsidie van de Stichting Whitehall en een NIH R21 naar QG.
Materials
| UAS-csChrimson | Bloomington Drosophila Stock Center | 55135 | Used as a neural activator |
| UAS-NaChBac | Bloomington Drosophila Stock Center | 9466 | Resotores excitibility in cells in TTX |
| Tetrodotoxin | Tochris | 1078 | Special permission may be needed to purchase TTX as it is a controlled substance |
| all trans-Retinal | Sigma-Aldrichall trans-Retinal | R2500 | Require co-factor for channelrhodopsin |
| Weldable 321 Stainless Steel Sheet, 0.002" Thick, 10" Wide | McMaster Carr | 3254K7 | Used to make custom fly holder. Custom foil can be laser cut at pololu.com from the provided PDF file |
| Dissection Microscope | Zeiss | Stemi 2000-C | Used for dissection of preparation |
| Waxer | Almore | Eectra Waxer 66000 | Used during dissection to secure fly in foil |
| Paraffin Wax | Joann | 4917217 | Used with waxer |
| Number 5 forceps | Fine Science Tools | #5CO | Used for dissection and desheathing |
| Dissection Scissors | Fine Science Tools | 15001-08 | Used to remove parts of the cuticle during dissection |
| Tungsten wire | A-M Systems | 797500 | Use with electrolysis to make sharpened needles for dissection |
| Reciculating Peristaltic Pump | Simply Pumps (Amazon) | PM200S | for recirculating TTX |
| Speed Controller for peristaltic pump | Zitrades (Amazon) | N/A | PWM Dimming Controller For LED Lights or Ribbon, 12 Volt 8 Amp,Adjustable Brightness Light Switch Dimmer Controller DC12V 8A 96W for Led Strip Light B |
| Versa-Mount Precision Compressed Air Regulator | McMaster Carr | 1804T1 | For applying positive pressure during patching |
| Glass capilaries | World Precision Instruments | TW150F-3 | For patch pipettes |
| Multipurpose Gauge | McMaster Carr | 3846K431 | Gauge for pressure regulator |
| Electrophysiology Camera | Dage MTI | IR-1000 | Any camera that works in the IR range (850 nm) will work. You do not want to use red illumination as this can activate csChrimson |
| IR LED | Thorlabs | M850F2 | For oblique illumination |
| fiber optic for IR LED | Thorlabs | M89L01 | Couples to IR LED |
| Objective lens | Olympus 40X | LUMPlanFLN | This can be used on most microscipes and works well for visualizing fly neurons. |
| Amber LED | Thorlabs | M590L3d | For visualizing RFP and mCherry |
| Blue LED | Thorlabs | M470L3d | For visualizing GFP |
| GFP filter set | Chroma | 49011 | For visualizing GFP or stimulating channel2rhodopsin |
| Custom mCherry Filter Set | Chroma | et580/25x and t600lpxr (from the 49306 set) but with an et610lp barrier/emission optic | Use only if you wish to patch identified neurons with channel2rhodopsin |
| Dichroic to combine Amber and blue LED | Thorlabs | DMLP550R | Use only patch under mCherry and excite channel2rhodopsin with blue light. |
| Red LED | LEDSupply | Cree XPE 620 – 630 nm | Used to drive csChrimson |
| LED Driver | LEDSupply | 3021-D-E-1000 | Used to drive LEDs for optogenetic stimulation |
| Manipulator | Sutter Instruments | MP-225 | Used to position pipette during recordings |
| Patchclamp Amplifier | A-M Systems | Model 2400 | An equivalent amplifier is suitable |
| Bessel Filter | Warner Instruments | LPF 202A | Auxillary filter used to filter current trace to oscilloscope during patching. |
| Data Acquisition System | National Instruments | NI PCIe-6321 781044-01 | Used to record data from amplifier to computer |
| Connector Block – BNC Terminal BNC-2090A | National Instruments | 779556-01 | Used to connect amplifier to DAQ card. |
| Steel Foil | McMaster Carr | 3254K7 | Steel foil for custom recording chamber |
| Magnets | K&J Magnetics | D42 | To secure recording chamber to ring stand |
| 1/16" Cell Cast Acrylic Clear | Pololu | Used to make custom recording chamber. Acrylic can be laser cut at pololu.com from the provided PDF file |
Referenzen
- Petreanu, L., Huber, D., Sobczyk, A., Svoboda, K. Channelrhodopsin-2-assisted circuit mapping of long-range callosal projections. Nat Neurosci. 10, 663-668 (2007).
- Yao, Z., Macara, A. M., Lelito, K. R., Minosyan, T. Y., Shafer, O. T. Analysis of functional neuronal connectivity in the Drosophila brain. J Neurophysiol. , 684-696 (2012).
- Doyle, M. W., Andresen, M. C. Reliability of monosynaptic sensory transmission in brain stem neurons in vitro. J Neurophysiol. 85, 2213-2223 (2001).
- Nicholls, J. G., Purves, D. Monosynaptic chemical and electrical connexions between sensory and motor cells in the central nervous system of the leech. J Physiol-London. 209, 647-667 (1970).
- Byrne, J. H., Castellucci, V. F., Kandel, E. R. Contribution of individual mechanoreceptor sensory neurons to defensive gill-withdrawal reflex in Aplysia. J Neurophysiol. 41, 418-431 (1978).
- Liao, X., Walters, E. T. The use of elevated divalent cation solutions to isolate monosynaptic components of sensorimotor connections in Aplysia. J Neurosci Meth. 120, 45-54 (2002).
- Feinberg, E. H., et al. GFP Reconstitution Across Synaptic Partners (GRASP) Defines Cell Contacts and Synapses in Living Nervous Systems. Neuron. 57, 353-363 (2008).
- Macpherson, L. J., et al. Dynamic labelling of neural connections in multiple colours by trans-synaptic fluorescence complementation. Nat Commun. 6, 10024-10029 (2015).
- Zhang, X., Gaudry, Q. Functional integration of a serotonergic neuron in the Drosophila antennal lobe. Elife. 5, (2016).
- Wilson, R. I. Early olfactory processing in Drosophila: mechanisms and principles. Annu Rev Neurosci. 36, 217-241 (2013).
- Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nat Methods. 11, 338-346 (2014).
- Murthy, M., Turner, G. C. Whole-cell in vivo patch-clamp recordings in the Drosophila brain. Cold Spring Harb Protoc. , 140-148 (2013).
- Murthy, M., Turner, G. C. Dissection of the head cuticle and sheath of living flies for whole-cell patch-clamp recordings in the brain. Cold Spring Harb Protoc. 2013, 134-139 (2013).
- Gu, H., O’Dowd, D. K. Whole Cell Recordings from Brain of Adult Drosophila. J Vis Exp. , (2007).
- Wilson, R. I., Turner, G. C., Laurent, G. Transformation of olfactory representations in the Drosophila antennal lobe. Science. 303, 366-370 (2004).
- Kazama, H., Wilson, R. I. Homeostatic Matching and Nonlinear Amplification at Identified Central Synapses. Neuron. 58, 401-413 (2008).
- Becnel, J., et al. DREADDs in Drosophila: a pharmacogenetic approach for controlling behavior, neuronal signaling, and physiology in the fly. Cell Reports. 4, 1049-1059 (2013).
- Armbruster, B. N., Li, X., Pausch, M. H., Herlitze, S., Roth, B. L. Evolving the lock to fit the key to create a family of G protein-coupled receptors potently activated by an inert ligand. P Natl Acad Sci USA. 104, 5163-5168 (2007).
- Sun, Q. Q., Wang, X., Yang, W. Laserspritzer: A Simple Method for Optogenetic Investigation with Subcellular Resolutions. PLoS One. 9, e101600-e101608 (2014).
- Holloway, B. B., et al. Monosynaptic Glutamatergic Activation of Locus Coeruleus and Other Lower Brainstem Noradrenergic Neurons by the C1 Cells in Mice. J Neurosci. 33, 18792-18805 (2013).
- Petreanu, L., Mao, T., Sternson, S. M., Svoboda, K. The subcellular organization of neocortical excitatory connections. Nature. 457, 1142-1145 (2009).
- Kloppenburg, P., Ferns, D., Mercer, A. R. Serotonin enhances central olfactory neuron responses to female sex pheromone in the male sphinx moth manduca sexta. J Neurosci. 19, 8172-8181 (1999).
- Suster, M. L., Seugnet, L., Bate, M., Sokolowski, M. B. Refining GAL4-driven transgene expression in Drosophila with a GAL80 enhancer-trap. Genesis. 39, 240-245 (2004).
