בחינת חיבורים Monosynaptic דרוזופילה באמצעות ערוצי נתרן עמיד לטטרודוקסין
Summary
מאמר זה כולל שיטה לבדוק את החיבורים monosynaptic בין נוירונים בהחלת טטרודוטוקסין וערוץ עמידים טטרודוטוקסין נתרן, NaChBac.
Abstract
. הנה, טכניקה חדשה כינה Tetrotoxin (TTX) מהונדסים ההתנגדות של חיטוט Synapses (TERPS) מוחל לבדיקת monosynaptic קשרים בין נוירונים היעד. השיטה מסתמכת על ביטוי משותף activator הטרנסגניים עם הערוץ עמידים טטרודוטוקסין נתרן, NaChBac, ב presynaptic נוירון מסוים. קשרים עם שותפים הפוסט-סינפטית בשם נקבעים לפי כל-תא הקלטות בנוכחות TTX, אשר חוסם פעילות חשמלית בנוירונים המבטאים לא NaChBac. גישה זו יכול להיות שונה כדי לעבוד עם activator או סידן הדמיה ככתב של חיבורים. TERPS מוסיף ערכת הכלים הזמינים עבור קביעת קישוריות בתוך רשתות הולך וגדל. עם זאת, TERPS הוא ייחודי בכך שהוא גם אמין ידווח בצובר או אמצעי שידור ושידור והתאמת.
Introduction
יעד מרכזי של מדעי המוח הוא למפות את הקשרים בין הנוירונים כדי להבין כיצד מידע זורם דרך מעגלים. גישות ומשאבים רבים הפכו להיות זמין לבדוק את תפקודי קישוריות בין הנוירונים בטווח של דגם מערכות1,2. כדי להפיק את תרשימים בחיווט המדויקות ביותר באמצעות אלקטרופיזיולוגיה, חשוב לפתור אם חיבורים שנצפה בין שני תאים הם monosynaptic לעומת עקיף ו polysynaptic הישירים. תקן הזהב להכנת הבחנה זו בנוירונים יונקים זה מודדים ההשהיה בין יחיד action potentials בתאים presynaptic תחילתה של זרמי postsynaptic מעוררים (EPSCs) בתוך הנוירון השני. חיבורים monosynaptic צריך השהיות ארוכות יותר קצר של כמה אלפיות השניה, השתנות נמוכה3. גישה זו יכולה להיות מסובכת בנוירונים הגעה מכיוון הסינפסות עלולה להתרחש שלהם דנדריטים רחוק באתר הקלטה הסומטית, גרימת עיכובים בזיהוי בשל המרחקים זמן electrotonic בין postsynaptic conductances את ההקלטה אלקטרודה. עיכובים כאלה יכולים להציג את עמימות בנוגע פולי-לעומת תרומות monosynaptic. בנוסף, אירועים קטנים סינפטית ייתכן ריקבון לפני שמגיעים לאתר הקלטות הסומטית, נהיגה פעילות presynaptic חזק יותר, סביר להניח לגייס אירועים polysynaptic.
טכניקות שונות פותחו כדי לבדוק חיבורים monosynaptic חסרי חוליות. גישה אחת משתמשת הקטיון כלט גבוהה פתרונות (Hi-Di) המכילים עודף מ ג++ ו- Ca++. פתרון זה חוסמת חיבורים polysynaptic על-ידי הפחתת שחרור ההסתברות הסף הגדלת פוטנציאל הפעולה לטובת גילוי של קלט monosynaptic4,5. קביעת היחס המדויק של מ ג++ ל Ca++ הנדרשים, עם זאת, לא טריוויאלי, תרומות polysynaptic עלול להימשך אפילו צנוע גירוי6. גישה חלופית בשם GFP שיחזור על פני סינפטית שותפים (תפיסה) מנצל הקירבה בין ממברנות קדם ו postsynaptic ב הסינפסות להסיק חיבור monosynaptic 7. . הנה, רכיב של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP), מתבטאת נוירון אחד, הרסיס משלימים של המולקולה מתבטאת שותף postsynaptic בשם. הנוכחות של קרינה פלואורסצנטית מציין כי שני הנוירונים נמצאים מספיק קרוב מאוד להתיר הכינון של מולקולת ה-GFP, מרמז על קיום סינפסה. תפיסתו יכולים לדווח הסינפסות זכריה, אם שני תאים יש קשר הדוק אני בטוחה ממברנות, כמו עצב או fascicle. וריאציות של תפיסתו לחסל תוצאות חיוביות שגויות כאלה על ידי קשירה של שבר presynaptic של GFP ישירות אל synaptobrevin, ובכך מאפשר שיחזור רק ב הסינפסות פעיל8. בעוד תפיסתו והווריאנטים שלה היה תפקיד חשוב בקביעת פונקציונלי קישוריות דרוזופילה CNS, קשרים לא עשויים להיות גלויים לפי תפיסתו אם המרחקים בין שותפים קדם ו postsynaptic גדול יחסית. זה רלוונטי במיוחד על פי הערכות של העברת אמצעי האחסון המשויך neuromodulation9 או עיכוב GABAergic10.
כאן, טכניקה משלימה ואת הרומן הוא הפגין לבדיקה חיבורים ישירים monosynaptic דרוזופילה CNS. שיטה זו, הנקראת טטרודוטוקסין מהונדסים ההתנגדות על חיטוט Synapses (TERPS), פועלת על-ידי ביטוי משותף טטרודוקסין (TTX)-ערוץ נתרן עמידים NaChBac, של optogenetic activator בתא presynaptic תוך כדי הקלטה מ בשם שותפים postsynaptic9. בנוכחות TTX, מדוכא כל פעילות בתיווך פוטנציאל הפעולה בתאים שאינם לבטא NaChBac. ערוץ NaChBac משחזר באופן סלקטיבי דעתנית ב יישוב presynaptic תא (ים), המתיר הסינאפסית עורר-אור. שיטה זו מאפשרת הפעלה חזקה של הנוירונים presynaptic, כך חיבורים יכולים להיפתר postsynaptically על ידי הקלטה סומאטית תוך צמצום ההסתברות של גיוס מעגלים polysynaptic. חשוב, טכניקה זו מאפשרת לימוד אמצעי שידור, חושף את התפשטות המשדר שוחררו נוירון בודד לאורך כל מעגל. בנוסף, TERPS יכול לחשוף הטבע כימי של החיבור באמצעות פרמקולוגיה קונבנציונלי. TERPS מתאים לשימוש בכל מערכת מודל המאפשר את הביטוי הטרנסגניים של תעלות נתרן TTX-רגישות.
Protocol
Representative Results
Discussion
ניתוח TERPS מחמאות הנוכחי טכניקות המשמשות עבור מעגל פיצוח על-ידי הפיכת זיהוי הסינפסות בין נוירונים שזוהה. באופן ספציפי, הגישה חושף קשרים monosynaptic על ידי בהרחבה להשתיק פוטנציאל פעולה עם TTX בעת שיחזור דעתנית אוכלוסיה בחירה של נוירונים עם תעלת נתרן TTX-רגישות NaChBac. שחרור סינפטית היא שהפיק optogenetic גי?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות יהושע זינגר, ג’ונתן שנק, כמו גם מתחשב בודקים עבור הערות על כתב היד. כן נרצה להודות לבן בן, הרולד אשות לדיונים על הטכניקה. ג’ונתן שנק סיפקה את הנתונים עבור איור 3A. עבודה זו נתמכה על ידי מענק קרן וייטהול, R21 של NIH על QG.
Materials
| UAS-csChrimson | Bloomington Drosophila Stock Center | 55135 | Used as a neural activator |
| UAS-NaChBac | Bloomington Drosophila Stock Center | 9466 | Resotores excitibility in cells in TTX |
| Tetrodotoxin | Tochris | 1078 | Special permission may be needed to purchase TTX as it is a controlled substance |
| all trans-Retinal | Sigma-Aldrichall trans-Retinal | R2500 | Require co-factor for channelrhodopsin |
| Weldable 321 Stainless Steel Sheet, 0.002" Thick, 10" Wide | McMaster Carr | 3254K7 | Used to make custom fly holder. Custom foil can be laser cut at pololu.com from the provided PDF file |
| Dissection Microscope | Zeiss | Stemi 2000-C | Used for dissection of preparation |
| Waxer | Almore | Eectra Waxer 66000 | Used during dissection to secure fly in foil |
| Paraffin Wax | Joann | 4917217 | Used with waxer |
| Number 5 forceps | Fine Science Tools | #5CO | Used for dissection and desheathing |
| Dissection Scissors | Fine Science Tools | 15001-08 | Used to remove parts of the cuticle during dissection |
| Tungsten wire | A-M Systems | 797500 | Use with electrolysis to make sharpened needles for dissection |
| Reciculating Peristaltic Pump | Simply Pumps (Amazon) | PM200S | for recirculating TTX |
| Speed Controller for peristaltic pump | Zitrades (Amazon) | N/A | PWM Dimming Controller For LED Lights or Ribbon, 12 Volt 8 Amp,Adjustable Brightness Light Switch Dimmer Controller DC12V 8A 96W for Led Strip Light B |
| Versa-Mount Precision Compressed Air Regulator | McMaster Carr | 1804T1 | For applying positive pressure during patching |
| Glass capilaries | World Precision Instruments | TW150F-3 | For patch pipettes |
| Multipurpose Gauge | McMaster Carr | 3846K431 | Gauge for pressure regulator |
| Electrophysiology Camera | Dage MTI | IR-1000 | Any camera that works in the IR range (850 nm) will work. You do not want to use red illumination as this can activate csChrimson |
| IR LED | Thorlabs | M850F2 | For oblique illumination |
| fiber optic for IR LED | Thorlabs | M89L01 | Couples to IR LED |
| Objective lens | Olympus 40X | LUMPlanFLN | This can be used on most microscipes and works well for visualizing fly neurons. |
| Amber LED | Thorlabs | M590L3d | For visualizing RFP and mCherry |
| Blue LED | Thorlabs | M470L3d | For visualizing GFP |
| GFP filter set | Chroma | 49011 | For visualizing GFP or stimulating channel2rhodopsin |
| Custom mCherry Filter Set | Chroma | et580/25x and t600lpxr (from the 49306 set) but with an et610lp barrier/emission optic | Use only if you wish to patch identified neurons with channel2rhodopsin |
| Dichroic to combine Amber and blue LED | Thorlabs | DMLP550R | Use only patch under mCherry and excite channel2rhodopsin with blue light. |
| Red LED | LEDSupply | Cree XPE 620 – 630 nm | Used to drive csChrimson |
| LED Driver | LEDSupply | 3021-D-E-1000 | Used to drive LEDs for optogenetic stimulation |
| Manipulator | Sutter Instruments | MP-225 | Used to position pipette during recordings |
| Patchclamp Amplifier | A-M Systems | Model 2400 | An equivalent amplifier is suitable |
| Bessel Filter | Warner Instruments | LPF 202A | Auxillary filter used to filter current trace to oscilloscope during patching. |
| Data Acquisition System | National Instruments | NI PCIe-6321 781044-01 | Used to record data from amplifier to computer |
| Connector Block – BNC Terminal BNC-2090A | National Instruments | 779556-01 | Used to connect amplifier to DAQ card. |
| Steel Foil | McMaster Carr | 3254K7 | Steel foil for custom recording chamber |
| Magnets | K&J Magnetics | D42 | To secure recording chamber to ring stand |
| 1/16" Cell Cast Acrylic Clear | Pololu | Used to make custom recording chamber. Acrylic can be laser cut at pololu.com from the provided PDF file |
Referenzen
- Petreanu, L., Huber, D., Sobczyk, A., Svoboda, K. Channelrhodopsin-2-assisted circuit mapping of long-range callosal projections. Nat Neurosci. 10, 663-668 (2007).
- Yao, Z., Macara, A. M., Lelito, K. R., Minosyan, T. Y., Shafer, O. T. Analysis of functional neuronal connectivity in the Drosophila brain. J Neurophysiol. , 684-696 (2012).
- Doyle, M. W., Andresen, M. C. Reliability of monosynaptic sensory transmission in brain stem neurons in vitro. J Neurophysiol. 85, 2213-2223 (2001).
- Nicholls, J. G., Purves, D. Monosynaptic chemical and electrical connexions between sensory and motor cells in the central nervous system of the leech. J Physiol-London. 209, 647-667 (1970).
- Byrne, J. H., Castellucci, V. F., Kandel, E. R. Contribution of individual mechanoreceptor sensory neurons to defensive gill-withdrawal reflex in Aplysia. J Neurophysiol. 41, 418-431 (1978).
- Liao, X., Walters, E. T. The use of elevated divalent cation solutions to isolate monosynaptic components of sensorimotor connections in Aplysia. J Neurosci Meth. 120, 45-54 (2002).
- Feinberg, E. H., et al. GFP Reconstitution Across Synaptic Partners (GRASP) Defines Cell Contacts and Synapses in Living Nervous Systems. Neuron. 57, 353-363 (2008).
- Macpherson, L. J., et al. Dynamic labelling of neural connections in multiple colours by trans-synaptic fluorescence complementation. Nat Commun. 6, 10024-10029 (2015).
- Zhang, X., Gaudry, Q. Functional integration of a serotonergic neuron in the Drosophila antennal lobe. Elife. 5, (2016).
- Wilson, R. I. Early olfactory processing in Drosophila: mechanisms and principles. Annu Rev Neurosci. 36, 217-241 (2013).
- Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nat Methods. 11, 338-346 (2014).
- Murthy, M., Turner, G. C. Whole-cell in vivo patch-clamp recordings in the Drosophila brain. Cold Spring Harb Protoc. , 140-148 (2013).
- Murthy, M., Turner, G. C. Dissection of the head cuticle and sheath of living flies for whole-cell patch-clamp recordings in the brain. Cold Spring Harb Protoc. 2013, 134-139 (2013).
- Gu, H., O’Dowd, D. K. Whole Cell Recordings from Brain of Adult Drosophila. J Vis Exp. , (2007).
- Wilson, R. I., Turner, G. C., Laurent, G. Transformation of olfactory representations in the Drosophila antennal lobe. Science. 303, 366-370 (2004).
- Kazama, H., Wilson, R. I. Homeostatic Matching and Nonlinear Amplification at Identified Central Synapses. Neuron. 58, 401-413 (2008).
- Becnel, J., et al. DREADDs in Drosophila: a pharmacogenetic approach for controlling behavior, neuronal signaling, and physiology in the fly. Cell Reports. 4, 1049-1059 (2013).
- Armbruster, B. N., Li, X., Pausch, M. H., Herlitze, S., Roth, B. L. Evolving the lock to fit the key to create a family of G protein-coupled receptors potently activated by an inert ligand. P Natl Acad Sci USA. 104, 5163-5168 (2007).
- Sun, Q. Q., Wang, X., Yang, W. Laserspritzer: A Simple Method for Optogenetic Investigation with Subcellular Resolutions. PLoS One. 9, e101600-e101608 (2014).
- Holloway, B. B., et al. Monosynaptic Glutamatergic Activation of Locus Coeruleus and Other Lower Brainstem Noradrenergic Neurons by the C1 Cells in Mice. J Neurosci. 33, 18792-18805 (2013).
- Petreanu, L., Mao, T., Sternson, S. M., Svoboda, K. The subcellular organization of neocortical excitatory connections. Nature. 457, 1142-1145 (2009).
- Kloppenburg, P., Ferns, D., Mercer, A. R. Serotonin enhances central olfactory neuron responses to female sex pheromone in the male sphinx moth manduca sexta. J Neurosci. 19, 8172-8181 (1999).
- Suster, M. L., Seugnet, L., Bate, M., Sokolowski, M. B. Refining GAL4-driven transgene expression in Drosophila with a GAL80 enhancer-trap. Genesis. 39, 240-245 (2004).
