Détection de détergent-sensibles aux Interactions entre les protéines membranaires
Summary
Les auteurs décrivent un protocole pour la détection de détergent sensible des interactions entre les protéines de la membrane à l’aide de liaison du récepteur tri, SORTILINE, pour la première boucle luminale de la protéine de transport du glucose, GLUT4, à titre d’exemple.
Abstract
Notre capacité d’explorer les interactions protéine-protéine est la clé pour comprendre la réglementation connexions dans la cellule. Cependant, détection d’interactions protéine-protéine dans bien des cas est associée à des défis importants expérimentales. En particulier, les récepteurs tris interagissent avec leur cargaison de protéines dans la lumière des compartiments membranaires souvent de façon sensible à détergent, ce qui rend inutilisable le co-immunoprécipitation de ces protéines. La liaison de la SORTILINE récepteur tri au transporteur du glucose que GLUT4 peut servir d’exemple de luminal de faibles interactions entre les protéines membranaires. Nous décrivons ici un essai rapide, simple et peu coûteux pour valider l’interaction entre SORTILINE et GLUT4. Pour cela, nous avons conçu et synthétisé chimiquement le peptide myc-le tag correspondant à l’épitope SORTILINE liaison potentielle dans la partie luminale de GLUT4. SORTILINE Taggé six histidines a été exprimé dans les cellules de mammifères et isolé de lysats de cellules à l’aide de perles de Cobalt. SORTILINE immobilisé sur les perles est incubée avec la solution de peptide à différentes valeurs de pH, et la substance éluée a été analysée par Western Blot. Ce dosage peut être facilement adapté pour étudier d’autres interactions de protéine-protéine de détergent-sensible.
Introduction
GLUT4 est une protéine de transport du glucose qui est exprimée principalement dans les cellules de graisse et le muscle squelettique où il intervient dans l’effet de l’insuline sur post-prandiale sang glucose dégagement1. Une protéine très stable, GLUT4 est réglementée au niveau post-traductionnelle. En l’absence d’insuline, GLUT4 est largement exclus de la membrane plasmique (donc faible perméabilité basale pour le glucose) et est localisée principalement à l’intérieur de la cellule en petites vésicules insulino-sensible (IRVs) et le réseau trans-Golgi (TGN) qui est susceptible de représenter le compartiment donneur IRV. Après l’administration d’insuline, les IRVs fusionnent avec la membrane plasmique et livrer GLUT4 sur le site de son fonctionnement. Cela augmente la perméabilité de la membrane plasmique pour le glucose, alors que l’absorption du glucose du sang dans les adipocytes et les myocytes squelettiques augmente de 10 à 40 fois. Après le retrait de l’insuline, GLUT4 est internalisée dans les endosomes précoces/tri et puis Récupérée à TGN où les IRVs sont reformés. Les deux tri étapes dans la voie de GLUT4, c’est-à-dire la récupération depuis le périphérique endosomes précoces à le périnucléaire TGN et la formation des IRVs sur le donateur TGN membranes sont activées par le membre de la famille Vps10p, SORTILINE, qui représente un type j’ai protéine transmembranaire et un récepteur de tri. Selon un même modèle, SORTILINE fonctionne comme une protéine transmembranaire échafaud : il lie GLUT4 dans la lumière des endosomes et TGN et recrute des adaptateurs retromer ou clathrine du côté cytoplasmique de la membrane de donneur le via son extrémité C-terminale2, 3. ce qui facilite la distribution de GLUT4 dans les transporteurs vésiculaires qui translocation GLUT4 entre les compartiments intracellulaires.
L’interaction de la queue cytoplasmique de SORTILINE avec retromer et diverses protéines adaptateur a été bien documentée. Toutefois, la liaison de la SORTILINE à GLUT4 (et à plusieurs de ses autres ligands de protéine) a été difficile à prouver. En particulier, tente de co-immunoprécipitation SORTILINE et GLUT4 n’ont pas été réussie, probablement en raison de la nature de détergent sensible de l’interaction entre ces deux protéines. En outre, comme une protéine de transport typique, GLUT4 a 12 domaines transmembranaires et 6 boucles luminales toute combinaison qui peut représenter un site de liaison SORTILINE. Dans le même temps, un grand nombre de preuves indirectes, comme la co-localisation substantielle dans la cellule, réticulation avec DSP membrane perméable et l’interaction de deux système hybride de levure suggèrent que SORTILINE peut lier à GLUT4. En outre, en utilisant l’approche de ce dernier dans une combinaison avec l’alanine mutagénèse d’analyse, nous avons précédemment déterminé que le domaine Vps10p de SORTILINE lie principalement à la première boucle luminale de GLUT4. Toutefois, la preuve d’une telle interaction dans les cellules de mammifères est porté disparue. Ici, nous avons isolé la SORTILINE His-tag de cellules transfectées 3 t 3-L1 à l’aide de résine de cobalt et démontré qu’il peut interagir avec le peptide synthétisé chimiquement correspondant à la première boucle luminale de GLUT4 à pH 6 et 8 qui ressemblent à un milieu acide dans le endosomale lumen et environnement neutre dans la lumière des membranes TGN. Aucune liaison peptide a été détecté dans des expériences de contrôle où les extraits préparés à partir de cellules non transfectées a été chargé sur les billes de mêmes.
Protocol
Representative Results
Discussion
SORTILINE est un récepteur évolutionnaire protéine conservée de multi-ligand qui est impliqué dans les deux la signalisation à la membrane plasmique et intracellulaire tri événements6,7. Cependant, la recherche de ligands de la SORTILINE authentique (dont certains sont des protéines de la membrane luminale ou intégrale) est compliquée comme l’interaction de la SORTILINE avec certains de ses partenaires de liaison semble être sensible aux détergents…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par des subventions de recherche DK52057 et DK107498 du NIH à K.V.K. X.P a été pris en charge par la 2T32DK007201 de subvention formation institutionnelle du NIH.
Materials
| Protease inhibitor cocktail | Sigma | P8849 | for use in purification of histidine tag protein |
| Phosphate-Buffered Saline | Corning | 21-040-CV | PBS |
| 1mL Insulin Syringe U-100 | BD | 329652 | 26G x 1/2 |
| BCA Protein Assay Kit | Pierce | 23228 | |
| Wash buffer | Boston BioProducts | BP-234 | For His-tag protein purification |
| HisPur Cobalt Resin | Thermo Scientific | 89964 | |
| Tricine sample Buffer | Bio-Rad | 161-0739 | with SDS, bMercaptaethanol should be added |
| Elution Buffer | Boston BioProducts | BP-236 | For His-tag protein purificationwith 250mM Imidazole |
| Mini-Protean Tris-Tricine precast gels 10-20% | Bio-Rad | 456-3115 | For seperation of peptide and small protein |
| Tris/Tricine/SDS running buffer | Bio-Rad | 161-0744 | |
| Transfer Buffer | Boston BioProducts | BP-190 | Add 20% methanol |
| Nitrocellulose membrane 0.45 mm | Bio-Rad | 1620115 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A9647 | BSA |
| Anti Myc antibody | Cell Signaling | 2272 | Rabbit |
| Peptide | Genscipt | customize ordering | |
| Precision Plus Protein Dual color Standarts | BioRad | 161-0374 |
Referenzen
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