Deteção de detergente sensíveis interações entre proteínas de membrana
Summary
Descreveremos um protocolo para a deteção de detergente sensíveis interações entre proteínas de membrana, usando a ligação do receptor classificação, sortilin, o primeiro loop luminal da proteína do transportador de glicose, GLUT4, como exemplo.
Abstract
Nossa capacidade de explorar as interações da proteína-proteína é a chave para a compreensão de conexões regulamentares na célula. No entanto, a detecção de interações da proteína-proteína em muitos casos é associada com desafios significativos experimentais. Em particular, classificação de receptores interagem com sua carga de proteína no lúmen dos compartimentos da membrana muitas vezes de forma sensível detergente, fazendo co-imunoprecipitação destas proteínas inutilizável. Ligação da classificação sortilin do receptor para o transportador de glicose que GLUT4 pode servir como um exemplo de fracos luminal interações entre proteínas de membrana. Aqui, descrevemos um ensaio rápido, simples e barato para validar a interação entre sortilin e GLUT4. Por isso, nós temos projetado e quimicamente sintetizado o peptídeo myc-tag correspondente para o potencial sortilin-ligação epítopo na parte luminal de GLUT4. Sortilin marcado com seis histidines foi expressa em células de mamíferos e isolada de lisados celulares usando grânulos de cobalto. Sortilin imobilizada em grânulos foi incubado com a solução de peptídeo em valores de pH diferentes, e o material eluted foi analisada pela mancha ocidental. Este ensaio pode ser facilmente adaptado para estudar outras interações da proteína-proteína de detergente sensíveis.
Introduction
GLUT4 é uma proteína de transporte de glicose que se expressa predominantemente nas células do músculo esquelético e gordura onde que medeia o efeito da insulina no sangue pós-prandial glicose autorização1. Sendo uma proteína muito estável, GLUT4 é regulada em um nível pós-traducional. Na ausência de insulina, GLUT4 é em grande parte excluídos da membrana plasmática (daí baixa permeabilidade basal de glicose) e está localizado principalmente no interior da célula em pequenas vesículas insulin-responsivos (IRVs) e rede trans-Golgi (TGN) que é provável que representam o compartimento do doador IRV. Após a administração de insulina, os IRVs se fundem com a membrana plasmática e entregam GLUT4 para o site do seu funcionamento. Isto aumenta a permeabilidade da membrana plasmática de glicose, assim a absorção de glicose do sangue em adipócitos e miócitos esqueléticos aumenta 10 a 40 vezes. Após a retirada da insulina, GLUT4 é interiorizado em endossomos iniciais/classificação e então obtida para TGN onde os IRVs são re-formados. Ambos classificação passos na via de GLUT4, ou seja, recuperação dos periféricos endossomos iniciais para o perinuclear TGN e a formação dos IRVs sobre o doador TGN membranas são ativadas pelo membro da família Vps10p, sortilin, que representa um tipo I proteína transmembranar e um receptor de classificação. De acordo com um modelo, o sortilin funciona como uma proteína transmembrana andaime: liga GLUT4 no lúmen dos endossomos e TGN e recrutas retromer ou Clatrina adaptadores para o lado citoplasmático da doadora membrana através de seu C-terminal2, 3. isso facilita a distribuição de GLUT4 em operadoras vesiculares que translocar GLUT4 entre compartimentos intracelulares.
A interação da cauda citoplasmática de sortilin com retromer e várias proteínas do adaptador tem sido bem documentada. No entanto, a ligação do sortilin GLUT4 (e vários de seus outros ligantes de proteína) tem sido desafiador para provar. Em particular, as tentativas de co-immunoprecipitate sortilin e GLUT4 não foram bem sucedidas, provavelmente devido à natureza de detergente sensível da interação entre estas duas proteínas. Além disso, como uma proteína de transporte típico, GLUT4 tem 12 domínios transmembranares e 6 loops luminal qualquer combinação de que potencialmente pode representar um sítio de ligação a sortilin. Ao mesmo tempo, um grande corpo de evidências indiretas, tais como localização co substancial na célula, cross-linking com DSP membrana permeável e a interação em dois sistema híbrido de levedura sugerem que sortilin pode ligar a GLUT4. Além disso, usando a última abordagem em uma combinação com a alanina digitalização mutagênese, nós determinamos anteriormente que o domínio de Vps10p de sortilin vincula-se principalmente para o primeiro loop luminal de GLUT4. No entanto, a prova de tal interação em células de mamíferos está desaparecido. Aqui, isolamos o sortilin com sua Tag de células transfectadas 3T3-L1 usando resina de cobalto e demonstrado que ele pode interagir com quimicamente sintetizado peptídeo correspondente ao primeiro loop luminal de GLUT4 no pH 6 e pH 8 que se assemelham a meio ácido na CDDP lúmen e ambiente neutro no lúmen das membranas TGN. Nenhuma ligação de peptídeo foi detectada em experimentos de controle onde o extrato preparado a partir de células transfectadas não foi carregado sobre as mesmas contas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sortilin é um receptor de proteína de ligante multi conservada evolucionária que está envolvido em ambos sinalização na membrana plasmática e no intracelular classificação eventos6,7. No entanto, a busca por ligantes do sortilin o autêntico (alguns dos quais são proteínas de membrana luminal ou integral) é complicada, como a interação do sortilin com alguns dos seus parceiros de ligação parece ser sensível aos detergentes. Portanto, uma fácil e…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pelo DK52057 e DK107498 do NIH para X.P de K.V.K foi apoiada pelo 2T32DK007201 de concessão a formação institucional do NIH de bolsas de investigação.
Materials
| Protease inhibitor cocktail | Sigma | P8849 | for use in purification of histidine tag protein |
| Phosphate-Buffered Saline | Corning | 21-040-CV | PBS |
| 1mL Insulin Syringe U-100 | BD | 329652 | 26G x 1/2 |
| BCA Protein Assay Kit | Pierce | 23228 | |
| Wash buffer | Boston BioProducts | BP-234 | For His-tag protein purification |
| HisPur Cobalt Resin | Thermo Scientific | 89964 | |
| Tricine sample Buffer | Bio-Rad | 161-0739 | with SDS, bMercaptaethanol should be added |
| Elution Buffer | Boston BioProducts | BP-236 | For His-tag protein purificationwith 250mM Imidazole |
| Mini-Protean Tris-Tricine precast gels 10-20% | Bio-Rad | 456-3115 | For seperation of peptide and small protein |
| Tris/Tricine/SDS running buffer | Bio-Rad | 161-0744 | |
| Transfer Buffer | Boston BioProducts | BP-190 | Add 20% methanol |
| Nitrocellulose membrane 0.45 mm | Bio-Rad | 1620115 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A9647 | BSA |
| Anti Myc antibody | Cell Signaling | 2272 | Rabbit |
| Peptide | Genscipt | customize ordering | |
| Precision Plus Protein Dual color Standarts | BioRad | 161-0374 |
Referenzen
- Bogan, J. S. Regulation of glucose transporter translocation in health and diabetes. Annu Rev Biochem. 81, 507-532 (2012).
- Kandror, K. V., Pilch, P. F. The sugar is sIRVed: sorting Glut4 and its fellow travelers. Traffic. 12 (6), 665-671 (2011).
- Pan, X., Zaarur, N., Singh, M., Morin, P., Kandror, K. V. Sortilin and retromer mediate retrograde transport of Glut4 in 3T3-L1 adipocytes. Mol Biol Cell. 28 (12), 1667-1675 (2017).
- Kim, J., Kandror, K. V. The first luminal loop confers insulin responsiveness to the glucose transporter 4. Mol Biol Cell. 23 (5), 910-917 (2012).
- Shi, J., Kandror, K. V. Sortilin is essential and sufficient for the formation of Glut4-storage vesicles in 3T3-L1 adipocytes. Dev Cell. 9 (1), 99-108 (2005).
- Coutinho, M. F., Prata, M. J., Alves, S. A shortcut to the lysosome: the mannose-6-phosphate-independent pathway. Mol Genet Metab. 107 (3), 257-266 (2012).
- Willnow, T. E., Petersen, C. M., Nykjaer, A. VPS10P-domain receptors – regulators of neuronal viability and function. Nat Rev Neurosci. 9 (12), 899-909 (2008).
- Mazella, J., et al. The 100-kDa neurotensin receptor is gp95/sortilin, a non-G-protein-coupled receptor. J Biol Chem. 273 (41), 26273-26276 (1998).
- Ni, X., Morales, C. R. The Lysosomal Trafficking of Acid Sphingomyelinase is Mediated by Sortilin and Mannose 6-phosphate Receptor. Traffic. 7 (7), 889-902 (2006).
- Westergaard, U. B., et al. Functional organization of the sortilin Vps10p domain. J Biol Chem. 279 (48), 50221-50229 (2004).
- Nykjaer, A., et al. Sortilin is essential for proNGF-induced neuronal cell death. Nature. 427 (6977), 843-848 (2004).
