בידוד של תאי פיטום, נגזר צפק ואיפיונן פונקציונלי עם Ca2 +-הדמיה, מבחני Degranulation
Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבודד ולטפח מאתר תאי פיטום הצפק. אנו גם מתארים שני פרוטוקולים עבור שלהם אפיון פונקציונלי: הדמיה פלורסנט תאיים חינם Ca2 + ריכוז ואת וזמינותו degranulation בהתבסס על ערכי צבע מוחלטים כימות β-ההקסוזאמינידאז שוחרר.
Abstract
תאי פיטום (MCs), כחלק של המערכת החיסונית, לשחק תפקיד מרכזי בהגנה על המחשב המארח נגד פתוגנים מספר, אתחול של התגובה החיסונית אלרגית. ההפעלה של MCs דרך cross-linking של משטח IgE מאוגד לקולטן IgE זיקה גבוהה (FcεRI), וכן באמצעות הגירוי של מספר רצפטורים אחרים, יוזם את עליית חינם תאיים Ca2 + רמת ([Ca2 +]אני) זה מקדם את השחרור של מתווכים דלקתיים ואני אלרגית. זיהוי מולקולרי המרכיבים המעורבים איתות המסלולים האלה חיונית להבנת ברגולציה של הפונקציה MC. במאמר זה, אנו מתארים פרוטוקול הבידוד של רקמת חיבור מאתר סוג MCs על ידי שטיפת הצפק, טיפוח של MCs הצפק (PMCs). של מודלים שונים של העכבר נוקאאוט על ידי מתודולוגיה זו תרבויות של MCs מייצגים גישה שימושי לזיהוי של החלבונים המעורבים MC מסלולי איתות. בנוסף, אנו גם לתאר את פרוטוקול תא בודד Fura-2 הדמיה כמו טכניקה חשוב עבור כימות של Ca2 + איתות ב MCs. מבוסס על-ידי קרינה פלואורסצנטית ניטור של [Ca2 +]אני הוא אמין, נפוץ גישה לימוד Ca2 + איתות האירועים, כולל ערך סידן המופעלים באמצעות החנות, אשר הוא בעל חשיבות עליונה עבור הפעלת MC. לניתוח של MC degranulation, נתאר assay שחרור של β-ההקסוזאמינידאז. הכמות של β-ההקסוזאמינידאז שוחרר לתוך המדיום תרבות נחשב סמן degranulation כל שלושה שונים הפרשה קבוצות משנה שמתואר MCs. β-ההקסוזאמינידאז בקלות ניתן לכמת את התגובה שלה עם מצע colorigenic ב צלחת microtiter assay ערכי צבע מוחלטים. טכניקה מאוד לשחזור זו היא חסכונית ואינו דורש שום ציוד מיוחד. בסך הכל, פרוטוקול שסופקו מדגים תשואה גבוהה של MCs ביטוי אופייני MC סמני פני השטח, הצגת תכונות אופייניות פנוטיפי מורפולוגיים של MCs ולאחר הוכחת תגובות מאוד לשחזור secretagogues ב Ca2 +– מבחני הדמיה ו degranulation.
Introduction
MCs תפקיד בולט במהלך תגובות חיסוניות מולדת ולא נרכשת. באופן ספציפי, MCs להשתתף ברצח של פתוגנים, כגון חיידקים, טפילים, ולבזות גם פפטידים אנדוגני רעיל או הרכיבים של venoms (עבור ראה סקירה גאלי ואח . 20081). תפקיד פיזיולוגי MCs חסינות מולדת, מסתגלת הוא הנושא של ויכוחים. לכן, הסתירות נתונים רבות במחקרים המתבצעים באמצעות מודלים שונים של העכבר חשוכת-MC דורשים הערכה מחדש שיטתית של פונקציות אימונולוגי של MCs מעבר אלרגיה2. MCs בוגרת מותאמים בעיקר רקמות ואיברים כגון עור, ריאות, בטן, נמצאים בדרך כלל רק במספרים קטנים בדם. MCs שואבים מבשרי hematopoietic, כגון MC אבות, והשלם שלהם בידול ההבשלה ב microenvironments של רקמות vascularized כמעט כל1. T-תא-derived factor אינטרלויקין (IL)-3 מקדם באופן סלקטיבי את הכדאיות, התפשטות, הבידול של אוכלוסיה pluripotent של העכבר MCs שלהם אבות hematopoietic3. תא גזע פקטור (SCF) המיוצר על ידי בתאי הרקמות מבנית ומשחק תפקיד מכריע MC פיתוח, הישרדות, הגירה, הפונקציה4. המאפיינים של MCs בודדות עשויות להשתנות בהתאם יכולתם לסנתז ולאחסן פרוטאזות או proteoglycans שונים. בעכברים, נבדלים של MCs כביכול רקמת חיבור מסוג MCs הרירית על פי שלהם לוקליזציה אנטומיים, מורפולוגיה ותוכן של הפארין ו פרוטאזות5.
ב MCs, גידול של חינם Ca cytosolic2 + ([Ca2 +]אני) היא הכרחית על degranulation וייצור של eicosanoids, כמו גם עבור הסינתזה של ציטוקינים והפעלה של גורמי שעתוק בתגובה אנטיגן, שונים secretagogues6. יעד במורד הזרם של גירויים אלה הוא phospholipase C, אשר הידרוליזה phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate diacylglycerol (DAG), אינוזיטול טריפוספט-1,4,5. דאג מפעיל חלבון קינאז C ו- IP3 משחרר יונים של Ca2 + מ רשתית תוך-פלזמית. דלדול של חנויות אלה מפעיל Ca2 + זרם דרך קרום פלזמה Ca2 + ערוצים, מובילים כדי לאחסן ערך סידן המופעלים (SOCE). תהליך זה ברמיזות האינטראקציה של Ca2 +-חיישן, אינטראקציה סטרומה המולקולה 1-(Stim1), רשתית תוך-פלזמית עם Orai17 , כמו גם דרך ההפעלה של ערוץ פוטנציאלי קולטן ארעי (TRPC) הקנונית חלבונים (עבור סקירה ראה Freichel. et al. 20148) ב קרום פלזמה.
ללמוד תפקיד פיזיולוגי של הערוצים הללו, מספר תרופתי (יישום של חוסמי ערוצים) או גישות גנטיות משמשים בדרך כלל. במקרה האחרון, דיכוי של ביטוי חלבון מושגת על ידי מיקוד mRNA (נוקאאוט) או דנ א גנומי עריכה עם מחיקת גלובלי או רקמות ספציפיות9 אקסון קידוד נקבובית ויוצרים יחידת משנה של ערוץ (הסתרה). הזמינות של חוסם עם ירידה לפרטים מספיק עבור הערוצים הללו הוא מוגבל. בנוסף, הגישה תמונות ציפורים דורש זהירות השליטה שלה ולייעל באמצעות, למשל-מערביות, כתם ניתוח, היא הקשו על ידי אי זמינות של נוגדנים ספציפיים עבור החלבון ערוץ יישוב במקרים רבים. לפיכך, השימוש של נוקאאוט העכבר מודלים עדיין נחשב תקן הזהב לניתוח כזה. מודל המועדפת במבחנה על חקירת פונקציות MC היא טיפוח של PMCs זה יכול להיות מבודד שמחוץ כאוכלוסייה לבגרות מלאה (לעומת הבחנה MCs במבחנה מ, למשל., תאים במח העצם)10 . לעומת מח עצם נגזר MCs (BMMCs), אשר גם משמשות ללמוד MC פונקציה במבחנה, הגירוי של FcεRI ובטא-ההקסוזאמינידאז שחרור גדל 8-fold ו 100-fold ב PMCs, בהתאמה. במאמר זה נתאר שיטת בידוד ואת טיפוח של מאתר PMCs, אשר מאפשר להשיג לאחר 2 שבועות של culturing מספר גבוה של רקמת חיבור טהור הקלד MCs, מספיקים לצורך ניתוח נוסף.
למרות התקדמותו האחרונה של פיתוח, יישום של סידן מקודדים גנטית אינדיקטורים, השימוש שלהם עדיין מוגבל על ידי קשיים בלידה של גנים לתאים היעד, באופן ספציפי, בתאים הפערים מיוחדים כגון ראשי MCs בתרבית. בנוסף, קבוצה זו של אינדיקטורים פלורסנט למדידות [Ca2 +]אני עדיין חסרה רציומטרי צבע עם טווח דינמי גבוה. מסיבות אלו, השיטה המועדפת על רציומטרי [Ca2 +]אני מידה הוא עדיין השימוש הפלורסנט “Fura-2”11.
כיום, הכי נפוץ הגישה על ההערכה של הפעלת MC, degranulation המדידה של β-ההקסוזאמינידאז פעילות. Β-ההקסוזאמינידאז, מתווך אלרגי, הוא אחד מרכיבי גרגר של MC זה שפורסמו במשותף עם היסטמין ביחס קבוע MCs12. Β-ההקסוזאמינידאז ניתן בקלות ובדייקנות למדוד באמצעות התגובה שלה עם מצע ספציפיים, אשר מייצרת כמות למדידה של מוצר colorigenic יצירותי ב assay ערכי צבע מוחלטים microplate. במאמר זה, מדווח יישום שיטה זו לניתוח של PMCs degranulation בתגובה מגוון רחב של גירויים.
צבירה של זיקה גבוהה קולטן IgE plasmalemmal (FcɛRI) מפעילה ב MCs רב-תכליתי תאיים איתות שביל, המוביל אל שחרור של גרגר הפרשה תוכן במרחב שמסביב חוץ-תאית. בנוסף אנטיגן ספציפי, הרבה גירויים אחרים יכולים להפעיל MCs לשחרר את מערך מגוון של מגשרים immunomodulatory, כגון anaphylatoxins המשלים (למשל., C3a, C5a)13, endothelin פפטיד את מצר את כלי הדם 1 (ET1)14 , כמו כן כמו רבים cationic חומרים ותרופות מעוררות תגובות pseudoallergic (למשל., icatibant)15 על ידי איגוד MRGPRX216. תאיים המעורבים MCs MRGPR-induced degranulation איתות המסלולים מאופיינים לקוי לעומת בתיווך FcɛRI איתות תאיים; המסלולים הללו רק החל להילמד באופן אינטנסיבי במהלך האחרון כמה שנים17 לאחר ה-זיהוי הקולטן16. במידה רבה, תעלות היונים קרום פלזמה מעורב ערך סידן ואחריו MRGPRX2 גירוי להישאר להיות מובן. לכן, המאמר הנוכחי מתמקד גם סידן תאיים באיתות, degranulation של MCs מגורה עם אגוניסטים MRGPR.
Protocol
Representative Results
Discussion
דגמי MC יכול לשמש בהצלחה ללמוד MC degranulation, כימוטקסיס, הדבקות, כמו גם באשר להסבר תאיים איתות התמרה חושית המסלולים המעורבים הפעלה MC. יש חוקרים שימוש אנושי MCs מודלים, כגון קווים מונצחים (LAD2 ו- HMC1) או MCs אנושי הנגזר כבל דם ובתאים (CD133 +) ודם היקפיים ובתאים (CD34 +). אחרים יעדיפו מכרסמים MC מודלים, כגון מונצח…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצה להכיר ג’וליה Geminn לקבלת סיוע טכני בארצות culturing והכנה תא פיטום. עבודה זו נתמכה על ידי המרכז לחקר שיתופי Transregional (TR-SFB) 152.
Materials
| RPMI Medium | Thermo Scientific | 21875034 | |
| DPBS | Sigma-Aldrich | 14190144 | |
| FCS | Thermo Scientific | R92157 | |
| IL-3 | R&D Systems | 403-ML | |
| SCF | Thermo Scientific | PMC2115 | |
| Concanavalin A | Sigma-Aldrich | C2272 | |
| Fura-2 AM | Thermo Fischer Scientific | F1221 | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | |
| DNP-HSA | Sigma-Aldrich | A6661 | |
| Anti-DNP-Antibody | Sigma-Aldrich | D-8406 | |
| Penstrep | Thermo Scientific | 15140122 | |
| Compound 48/80 | Sigma-Aldrich | C2313 | |
| 4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol | Sigma-Aldrich | X100 | |
| 4-Nitrophenyl 2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranoside | Sigma-Aldrich | N9376 | |
| CoverWell Imaging Chamber | Sigma-Aldrich | GBL635051 | |
| 96-Well plate, v-shaped bottom | Corning | 3896 | |
| 96-Well plates, flat bottom | Greiner Bio-One | 655180 | |
| Microtiter plate reader with "i-control" software | Tecan | Nano Quant, infinite M200 Pro | |
| Flat bottom plate | Greiner Bio-One | 655180 | |
| Ionomycin | Sigma-Aldrich | I9657 | |
| 50 mL Plastic Centrifuge Tubes | Sarstedt | 62.547.254 | |
| Culture Flasks (25 cm) | Greiner Bio-One | 69160 | |
| Cover slips glasses round; ø 25 mm; No. 1 | Menzel | CB00250RA1 | |
| Hemocytometer | VWR | 631-0696 | |
| Inverted Microscope | Zeiss | Observer Z1 | |
| Objectiv Fluar 40x/1.3 Oil | Zeiss | 440260-9900 | |
| HC Filter Set Fura 2 | AHF | H76-521 | |
| CCD Camera | Zeiss | AxioCam MRm | |
| Monochromatic Light Source | Sutter Instruments | Lambda DG-4 | |
| Imaging Acquisition Program | Zeiss | AxioVision 4.8.2 | |
| Gravity fed solution application system | Custom Made | 4-channel | |
| 15 mL Plastic Centrifuge Tubes | Sarstedt | 62,554,502 | |
| Bench Centrifuge | Heraeus | Megafuge 1.0R |
Referenzen
- Galli, S. J., Grimbaldeston, M., Tsai, M. Immunomodulatory mast cells: negative, as well as positive, regulators of immunity. Nat Rev Immunol. 8 (6), 478-486 (2008).
- Feyerabend, T. B., et al. Cre-mediated cell ablation contests mast cell contribution in models of antibody- and T cell-mediated autoimmunity. Immunity. 35 (5), 832-844 (2011).
- Razin, E., Cordon-Cardo, C., Good, R. A. Growth of a pure population of mouse mast cells in vitro with conditioned medium derived from concanavalin A-stimulated splenocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 78 (4), 2559-2561 (1981).
- Galli, S. J., Zsebo, K. M., Geissler, E. N. The kit ligand, stem cell factor. Adv Immunol. 55, 1-96 (1994).
- Galli, S. J., et al. Mast cells as “tunable” effector and immunoregulatory cells: recent advances. Annu Rev Immunol. 23, 749-786 (2005).
- Ma, H. T., Beaven, M. A. Regulators of Ca(2+) signaling in mast cells: Potential targets for treatment of mast cell-related diseases. Adv Exp Med Biol. 716, 62-90 (2011).
- Vig, M., et al. Defective mast cell effector functions in mice lacking the CRACM1 pore subunit of store-operated calcium release-activated calcium channels. Nat Immunol. 9 (1), 89-96 (2008).
- Freichel, M., Almering, J., Tsvilovskyy, V. The role of TRP proteins in mast cells. Front Immunol. 3, 150 (2014).
- Scholten, J., et al. Mast cell-specific Cre/loxP-mediated recombination in vivo. Transgenic Res. 17 (2), 307-315 (2008).
- Malbec, O., et al. Peritoneal cell-derived mast cells: An in vitro model of mature serosal-type mouse mast cells. J Immunol. 178 (10), 6465-6475 (2007).
- Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. J Biol Chem. 260 (6), 3440-3450 (1985).
- Schwartz, L. B., Austen, K. F., Wasserman, S. I. Immunologic release of beta-hexosaminidase and beta-glucuronidase from purified rat serosal mast cells. J Immunol. 123 (4), 1445-1450 (1979).
- Schafer, B., et al. Mast cell anaphylatoxin receptor expression can enhance IgE-dependent skin inflammation in mice. J Allergy Clin Immunol. 131 (2), 541-549 (2013).
- Maurer, M., et al. Mast cells promote homeostasis by limiting endothelin-1-induced toxicity. Nature. 432 (7016), 512-516 (2004).
- Maurer, M., Church, M. K. Inflammatory skin responses induced by icatibant injection are mast cell mediated and attenuated by H(1)-antihistamines. Exp Dermatol. 21 (1), 154-155 (2012).
- McNeil, B. D., et al. Identification of a mast-cell-specific receptor crucial for pseudo-allergic drug reactions. Nature. 519 (7542), 237-241 (2015).
- Gaudenzio, N., et al. Different activation signals induce distinct mast cell degranulation strategies. J Clin Invest. 126 (10), 3981-3998 (2016).
- Solis-Lopez, A., et al. Analysis of TRPV channel activation by stimulation of FCepsilonRI and MRGPR receptors in mouse peritoneal mast cells. PLoS One. 12 (2), 0171366 (2017).
- Enerback, L., Svensson, I. Isolation of rat peritoneal mast cells by centrifugation on density gradients of Percoll. J Immunol Methods. 39 (1-2), 135-145 (1980).
- Bird, G. S., DeHaven, W. I., Smyth, J. T., Putney, J. W. Methods for studying store-operated calcium entry. Methods. 46 (3), 204-212 (2008).
- Aronson, N. N., Kuranda, M. J. Lysosomal degradation of Asn-linked glycoproteins. FASEB J. 3 (14), 2615-2622 (1989).
- Moon, T. C., Befus, A. D., Kulka, M. Mast cell mediators: their differential release and the secretory pathways involved. Front Immunol. 5, 569 (2014).
