Aislamiento de mastocitos de peritoneo derivado y su caracterización funcional con Ca2 +-proyección de imagen y pruebas de degranulación
Summary
Aquí, presentamos un protocolo para aislar y cultivar células de mástil peritoneales murinas. También describimos dos protocolos para su caracterización funcional: una proyección de imagen fluorescente de la concentración de Ca libre2 + intracelular y una prueba de degranulación basado en la cuantificación colorimétrica de la β-hexosaminidasa lanzado.
Abstract
Mastocitos (MCs), como parte del sistema inmunológico, juegan un papel clave en la defensa del huésped contra varios patógenos y en la iniciación de la respuesta inmune alérgica. La activación de MCs por el cross-linking de superficie IgE limitado a receptor de IgE de alta afinidad (FcεRI), así como a través de la estimulación de varios otros receptores, inicia el ascenso del libre intracelular Ca2 + nivel ([Ca2 +]) que promueve la liberación de mediadores inflamatorios y alérgicos. La identificación de los componentes moleculares implicados en estas vías de señalización es fundamental para la comprensión de la regulación de la función de MC. En este artículo se describe un protocolo para el aislamiento de murine del tejido conectivo tipo MCs por lavado peritoneal y la cultivación de MCs peritoneales (CMP). Culturas de MCs de diferentes modelos de ratón knockout por esta metodología representan un método útil para la identificación de proteínas implicadas en rutas de señalización de MC. Además, también se describe un protocolo para la célula Fura-2 proyección de imagen como una importante técnica para la cuantificación de Ca2 + en MCs. basada en fluorescencia monitoreo de [Ca2 +] es un confiable y enfoque de uso general estudio de Ca2 + señalización de eventos, incluyendo la entrada de calcio con tienda que funciona, que es de suma importancia para la activación de MC. Para el análisis de MC degranulación, se describe un ensayo de liberación de β-hexosaminidasa. La cantidad de β-hexosaminidasa liberado en el medio de cultivo se considera como un marcador de degranulación para diferentes subconjuntos secretores de todos tres descrito en MCs. β-hexosaminidasa puede cuantificarse fácilmente por su reacción con un sustrato de colorigenic en un Análisis colorimétrico de la placa de microtitulación. Esta técnica altamente reproducible es rentable y no requiere ningún equipo especializado. En general, el protocolo siempre demuestra un alto rendimiento de MCs expresan marcadores de superficie típico MC, mostrando las características morfológicas y fenotípicas típicas de MCs y demostrando las respuestas altamente reproducibles a secretagogos en Ca2 +– Análisis de la proyección de imagen y degranulación.
Introduction
MCs juega un papel destacado durante las respuestas inmunitarias innatas y adquiridas. Específicamente, MCs participa en la muerte de patógenos, como bacterias y parásitos y también degradan péptidos endógenos potencialmente tóxicos o componentes de venenos (para revisión ver Galli et al. 20081). El papel fisiológico de MCs en la inmunidad innata y adaptativa es objeto de acalorado debate. Por lo tanto, las numerosas discrepancias de datos en los estudios realizados con diferentes modelos de ratón deficientes en MC requieren una reevaluación sistemática de las funciones inmunológicas de MCs más allá de alergia2. MCs madurados se localizan principalmente en tejidos y órganos como la piel, el pulmón y el intestino y generalmente sólo se encuentran en pequeña cantidad en la sangre. MCs derivan de precursores hematopoyéticos, como progenitores de MC y completar su diferenciación y maduración en los microambientes de casi todos los tejidos vascularizados1. Factor derivado de células T interleukin (IL) -3 selectivamente promueve la viabilidad, proliferación y diferenciación de una población de pluripotent del ratón MCs de sus progenitores hematopoyéticos3. Factor de células madre (SCF) es producida por células estructurales en los tejidos y desempeña un papel crucial en la MC desarrollo, supervivencia, la migración y función4. Las propiedades de los MCs pueden diferir dependiendo de su capacidad para sintetizar y almacenar diversas proteasas o proteoglicanos. En ratones, se distinguen el tipo de tejido conectivo denominada MCs de MCs mucosa según su localización anatómica, morfología y contenido de heparina y proteasas5.
En MCs, un aumento del libre citosólico Ca2 + ([Ca2 +]) es indispensable para la degranulación y producción de eicosanoides, así como para la síntesis de citoquinas y activación de factores de transcripción en respuesta a antígenos y varios secretagogos6. Un objetivo importante aguas abajo de estos estímulos es la fosfolipasa C que hidroliza el fosfatidilinositol 4, 5-bifosfato inositol 1,4,5-trifosfato y diacilglicerol (DAG). DAG activa la proteína quinasa C y IP3 libera iones de Ca2 + desde el retículo endoplásmico. Agotamiento de estas tiendas activa Ca2 + afluencia vía membrana plasmática Ca2 + , llevando a almacenar calcio operados entrada (SOCE). Este proceso es evocado a través de la interacción del Ca2 +-sensor, interacción stromal molecule-1 (Stim1), en el retículo endoplásmico con Orai17 , así como a través de la activación del canal de (TRPC) canónico potencial transitorio del receptor proteínas (para revisión ver Freichel et al. 20148) en la membrana plasmática.
Para estudiar el papel fisiológico de estos canales, varios farmacológico (uso de bloqueadores de los canales) o enfoques genéticos se utilizan típicamente. En este último caso, supresión de la expresión de la proteína se obtiene dirigiéndose a mRNA (caída) o ADN genómico con global o tejidos específicos9 canceladura de un exón codificación un poro formando la subunidad de un canal (eliminatorias). La disponibilidad de un bloqueador con suficiente especificidad para estos canales es limitada. Además, el enfoque de precipitación requiere un control cuidadoso de su efectividad mediante, por ejemplo., Western blot análisis y se ve obstaculizada por la falta de disponibilidad de anticuerpos específicos para la proteína de canal específicos en muchos casos. Así, el uso de modelos de ratón knockout todavía se considera como el estándar de oro para dicho análisis. Un modelo preferido en vitro para la investigación de las funciones de la MC es cultivo de CMP que pueden ser aisladas ex vivo como una población totalmente madura (a diferencia de la distinción de MCs en vitro de, por ejemplo., células de médula ósea)10 . En comparación con la médula ósea derivada de MCs (BMMCs), que también se utilizan para estudiar la función de MC en vitro, la estimulación de FcεRI y beta-hexosaminidase liberación aumenta 8 y 100-fold en CMP, respectivamente. En este artículo, describimos un método de aislamiento y cultivo de CMP murinas, que permite para obtener después de 2 semanas de cultivo de un elevado número de puro tejido conectivo tipo MCs, suficientes para su posterior análisis.
A pesar de recientes avances en el desarrollo y aplicación de indicadores genético codificados calcio, su uso es aún limitado por dificultades en la entrega de genes a las células diana, específicamente, en células altamente especializadas tales como MCs cultivadas primarios. Además, este grupo de indicadores fluorescentes de [Ca2 +] las mediciones aún carece de tintes radiométrica con un alto rango dinámico. Por estas razones, el método preferido para la medición radiométrica [Ca2 +] sigue siendo el uso del tinte fluorescente “Fura-2”11.
Actualmente, el más de uso general enfoque para la evaluación de MC activación y degranulación es la medida de actividad de β-hexosaminidasa. Β-hexosaminidasa, un mediador alérgico, es uno de los componentes de gránulo de MC que es lanzado conjuntamente con histamina en proporción constante de MCs12. Β-hexosaminidasa se puede medir fácilmente y con precisión a través de su reacción con un sustrato específico, que produce una cantidad mensurable de un producto colorigenic que es fácilmente detectable en un ensayo colorimétrico de microplacas. En este artículo, se divulga una aplicación de esta técnica para el análisis de las CMP degranulación en respuesta a una variedad de estímulos.
Agregación del receptor de IgE plasmalemmal de alta afinidad (FcɛRI) activa en MCs una vía de señalización intracelular versátil, conduce a una liberación del contenido de gránulos secretores en el espacio extracelular circundante. Además el antígeno específico, muchos otros estímulos pueden activar MCs para liberar una gran variedad de mediadores inmunomoduladores, como complemento anaphylatoxins (e.g., C3a y C5a)13, el péptido vasoconstrictor la endotelina 1 (ET1)14 , así como numerosas sustancias catiónicas y drogas provocando reacciones pseudoallergic (e.g., icatibant)15 atando a MRGPRX216. Vías de señalización intracelular implicados en la Desgranulación inducida por MRGPR MCs mal se caracterizan con respecto a la señalización intracelular mediada por el FcɛRI; estas vías sólo comenzaron a ser estudiado intensamente durante los últimos pocos años17 después de la identificación del receptor del16. Los membrana plasmática canales del ion en la entrada de calcio seguido por estimulación MRGPRX2 siguen siendo en gran parte, para ser entendido. Por lo tanto, el presente artículo se centra también en la señalización intracelular del calcio y degranulación de los MCs estimulado con agonistas de la MRGPR.
Protocol
Representative Results
Discussion
Modelos MC pueden utilizarse con éxito para el estudio de MC degranulación, quimiotaxis, adherencia, así como dilucidar vías intracelulares de transducción de señalización implicadas en la activación de MC. Algunos investigadores uso MCs los modelos humanos, como las líneas inmortalizadas (LAD2 y HMC1) o MCs humanas derivados de cordón de células progenitoras (CD133 +) y las células progenitoras de sangre periférica (CD34 +) de la sangre. Otros prefieren roedores modelos MC, como inmortalizados (leucemia bas…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean reconocer Julia Geminn para asistencia técnica en preparación de la célula de mástil y cultivo. Este trabajo fue apoyado por Fomento el centro de investigación colaborativa (TR-SFB) 152.
Materials
| RPMI Medium | Thermo Scientific | 21875034 | |
| DPBS | Sigma-Aldrich | 14190144 | |
| FCS | Thermo Scientific | R92157 | |
| IL-3 | R&D Systems | 403-ML | |
| SCF | Thermo Scientific | PMC2115 | |
| Concanavalin A | Sigma-Aldrich | C2272 | |
| Fura-2 AM | Thermo Fischer Scientific | F1221 | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | |
| DNP-HSA | Sigma-Aldrich | A6661 | |
| Anti-DNP-Antibody | Sigma-Aldrich | D-8406 | |
| Penstrep | Thermo Scientific | 15140122 | |
| Compound 48/80 | Sigma-Aldrich | C2313 | |
| 4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol | Sigma-Aldrich | X100 | |
| 4-Nitrophenyl 2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranoside | Sigma-Aldrich | N9376 | |
| CoverWell Imaging Chamber | Sigma-Aldrich | GBL635051 | |
| 96-Well plate, v-shaped bottom | Corning | 3896 | |
| 96-Well plates, flat bottom | Greiner Bio-One | 655180 | |
| Microtiter plate reader with "i-control" software | Tecan | Nano Quant, infinite M200 Pro | |
| Flat bottom plate | Greiner Bio-One | 655180 | |
| Ionomycin | Sigma-Aldrich | I9657 | |
| 50 mL Plastic Centrifuge Tubes | Sarstedt | 62.547.254 | |
| Culture Flasks (25 cm) | Greiner Bio-One | 69160 | |
| Cover slips glasses round; ø 25 mm; No. 1 | Menzel | CB00250RA1 | |
| Hemocytometer | VWR | 631-0696 | |
| Inverted Microscope | Zeiss | Observer Z1 | |
| Objectiv Fluar 40x/1.3 Oil | Zeiss | 440260-9900 | |
| HC Filter Set Fura 2 | AHF | H76-521 | |
| CCD Camera | Zeiss | AxioCam MRm | |
| Monochromatic Light Source | Sutter Instruments | Lambda DG-4 | |
| Imaging Acquisition Program | Zeiss | AxioVision 4.8.2 | |
| Gravity fed solution application system | Custom Made | 4-channel | |
| 15 mL Plastic Centrifuge Tubes | Sarstedt | 62,554,502 | |
| Bench Centrifuge | Heraeus | Megafuge 1.0R |
Referenzen
- Galli, S. J., Grimbaldeston, M., Tsai, M. Immunomodulatory mast cells: negative, as well as positive, regulators of immunity. Nat Rev Immunol. 8 (6), 478-486 (2008).
- Feyerabend, T. B., et al. Cre-mediated cell ablation contests mast cell contribution in models of antibody- and T cell-mediated autoimmunity. Immunity. 35 (5), 832-844 (2011).
- Razin, E., Cordon-Cardo, C., Good, R. A. Growth of a pure population of mouse mast cells in vitro with conditioned medium derived from concanavalin A-stimulated splenocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 78 (4), 2559-2561 (1981).
- Galli, S. J., Zsebo, K. M., Geissler, E. N. The kit ligand, stem cell factor. Adv Immunol. 55, 1-96 (1994).
- Galli, S. J., et al. Mast cells as “tunable” effector and immunoregulatory cells: recent advances. Annu Rev Immunol. 23, 749-786 (2005).
- Ma, H. T., Beaven, M. A. Regulators of Ca(2+) signaling in mast cells: Potential targets for treatment of mast cell-related diseases. Adv Exp Med Biol. 716, 62-90 (2011).
- Vig, M., et al. Defective mast cell effector functions in mice lacking the CRACM1 pore subunit of store-operated calcium release-activated calcium channels. Nat Immunol. 9 (1), 89-96 (2008).
- Freichel, M., Almering, J., Tsvilovskyy, V. The role of TRP proteins in mast cells. Front Immunol. 3, 150 (2014).
- Scholten, J., et al. Mast cell-specific Cre/loxP-mediated recombination in vivo. Transgenic Res. 17 (2), 307-315 (2008).
- Malbec, O., et al. Peritoneal cell-derived mast cells: An in vitro model of mature serosal-type mouse mast cells. J Immunol. 178 (10), 6465-6475 (2007).
- Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. J Biol Chem. 260 (6), 3440-3450 (1985).
- Schwartz, L. B., Austen, K. F., Wasserman, S. I. Immunologic release of beta-hexosaminidase and beta-glucuronidase from purified rat serosal mast cells. J Immunol. 123 (4), 1445-1450 (1979).
- Schafer, B., et al. Mast cell anaphylatoxin receptor expression can enhance IgE-dependent skin inflammation in mice. J Allergy Clin Immunol. 131 (2), 541-549 (2013).
- Maurer, M., et al. Mast cells promote homeostasis by limiting endothelin-1-induced toxicity. Nature. 432 (7016), 512-516 (2004).
- Maurer, M., Church, M. K. Inflammatory skin responses induced by icatibant injection are mast cell mediated and attenuated by H(1)-antihistamines. Exp Dermatol. 21 (1), 154-155 (2012).
- McNeil, B. D., et al. Identification of a mast-cell-specific receptor crucial for pseudo-allergic drug reactions. Nature. 519 (7542), 237-241 (2015).
- Gaudenzio, N., et al. Different activation signals induce distinct mast cell degranulation strategies. J Clin Invest. 126 (10), 3981-3998 (2016).
- Solis-Lopez, A., et al. Analysis of TRPV channel activation by stimulation of FCepsilonRI and MRGPR receptors in mouse peritoneal mast cells. PLoS One. 12 (2), 0171366 (2017).
- Enerback, L., Svensson, I. Isolation of rat peritoneal mast cells by centrifugation on density gradients of Percoll. J Immunol Methods. 39 (1-2), 135-145 (1980).
- Bird, G. S., DeHaven, W. I., Smyth, J. T., Putney, J. W. Methods for studying store-operated calcium entry. Methods. 46 (3), 204-212 (2008).
- Aronson, N. N., Kuranda, M. J. Lysosomal degradation of Asn-linked glycoproteins. FASEB J. 3 (14), 2615-2622 (1989).
- Moon, T. C., Befus, A. D., Kulka, M. Mast cell mediators: their differential release and the secretory pathways involved. Front Immunol. 5, 569 (2014).
