超低入力ヒトゲノム単一 Tardigrade の標本からのライブラリの準備
Summary
顕微鏡の有機体のゲノムのシーケンス処理中に汚染大きい問題に残る。ここでは、汚染のリスクを最小限に抑えるため全ゲノム増幅 DNA のわずか 50 pg を単一の標本からクマムシのゲノムをシーケンス処理する方法を示します。
Abstract
クマムシは、乾燥とすることができますに直面するときと呼ばれる乾燥耐性を元の状態に返すときに水が供給されて ametabolic 状態顕微鏡動物です。時々 これらの動物の遺伝子の水平伝達の範囲についてたとえば、誤った解釈につながるクマムシ リスク細菌汚染など顕微鏡動物のゲノム配列を決定。ここでは、我々 は単一の標本からHypsibius dujardiniクマムシのゲノムを配列する超低入力メソッドを提供します。50 の効率的な抽出と厳密な洗浄および汚染物質の除外を用いて 〜 200 pg 単一の個人からのゲノム DNA、DNA シーケンシング装置でシーケンス化されたライブラリを構築しました。これらのライブラリは、高い再現性で、公平をされ他h. dujardiniのゲノム シーケンスされた読み取りのインフォマティクス解析は汚染の最小限の量を示した。このメソッドは、以前の方法を使用していないシーケンスが難のクマムシに適用できます。
Introduction
クマムシは、乾燥に直面するとき、乾燥耐性と呼ばれる ametabolic 状態を入力することができます顕微鏡動物です。彼らは水1,2の吸収による回復します。Ametabolic 状態ではクマムシが極端な温度3高圧4、5ガンマ線、x 線、紫外線光6の高用量を含む様々 な極限環境に耐えることができます。7,8、および宇宙空間9。ゲノムデータは乾燥耐性の分子機構の研究のために不可欠な基礎です。
クマムシのゲノムをシーケンス処理する前の試みは、細菌汚染10、11,12,13,14の兆候を示しています。このような小さな生物からゲノム配列決定多数の動物を必要とし、細菌汚染になりやすいです。したがって、我々 は既に15汚染のリスクを最小限に抑えるため、クマムシの単一の標本から超低入力メソッドを使用してシーケンス プロトコルを確立されています。これらのデータを使用して、さらに実施した高品質の順序とH. dujardini16,17のゲノムの再構築。ここで述べるこの(図 1tardigrade 一個人からゲノム配列決定法)。このシーケンスの結果の検証は本稿の焦点を越えて、私たちの以前のレポート16で既に、徹底的に議論されています。
このメソッドは、2 つの部分で構成されています: 最低汚染可能と DNA のピクトグラム レベルの質の高い抽出単一クマムシの分離。海中でもは飢えたと抗生物質と同様に、水ですすぎ、任意の細菌汚染の除去を確実に 500 倍の倍率での顕微鏡で観察しました。以前の推定値と測定、クマムシの単一の個人にゲノム DNA の16、凍結融解のサイクルによってまたは手動の均質化によって、キチン質の外骨格を割れによって抽出される約 50 200 pg が含まれていることを示しています。この DNA は、図書館の建設に提出し、DNA シーケンシング装置でシーケンス処理します。追加情報分析は、以前の tardigrade シーケンス プロジェクトと比較して汚染の低レベルと同様、高品質のシーケンスを示しています。
Protocol
Representative Results
Discussion
細菌汚染は、微生物のゲノム配列決定に脅威を与えます。Tardigrade ゲノムに関する先行研究を広範な情報学研究の方法12,20を使用して汚染をフィルター処理、一方我々 は汚染のリスクを最小限に抑えるために単一の個人からゲノムをシーケンスです。個々 緩歩動物ゲノム DNA16の約 50-200 pg が含まれているキチン質の外骨格の厚い層…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者はゲノム配列決定でテクニカル サポートのため希阿部、希高井菜穂子石井をありがちましょう。この作業によって支えられた費日本社会のための科学振興会研究員、科研費科研費若手 (No.22681029)、科研費科研費研究 (B)、第 17 H 03620、日本学術振興会からので、基本的な科学研究プロジェクト、住友財団 (No.140340) から、山形県・鶴岡市から研究資金によって部分的に助成。クロレラクマムシをフィードするために使用されたベルフォートは、クロレラ工業 (株)
Materials
| SZ61 microscope | OLYMPUS | ||
| BactoAgar | Difco Laboratories | 214010 | |
| Penicillin Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco by life technologies | 15140-148 | |
| VHX-5000 System | Keyence | ||
| 0.2mL Silicone coating tube | Bio Medical Science | BC-bmb20200 | |
| Quick-DNA Microprep Kit | ZYMO Research | D3021 | Use of this kit is absolutey critical; see step 3.1 |
| 1.5 mL microtube | greiner bio-one | 616-201 | See 4.1.1 |
| HIgh speed refrigerated micro centrifuge | TOMY | MX-307 | |
| Covaris M220 | Covaris Inc. | 4482277 | |
| ThruPLEX DNA-Seq kit | Rubicon Genomics | CAT. NO. R400406 | Use of this kit is absolutey critical; see step 4.2 |
| Thermal Cycler | Bioer Technology | TC-96GHbC | |
| AMPure XP reagent | BECKMAN COULTER Life Science | A63881 | |
| Ethanol | Wako | 054-027335 | |
| EB buffer | QIAGEN | 19086 | |
| 2200 TapeStation | Agilent | G2965AA | |
| D1000 Reagents | Agilent | 5067-5583 | |
| D1000 ScreenTape | Agilent | 5067-5582 | |
| Qubit dsDNA BR Buffer/Reagent | ThermoFisher Scientific | Q32850 | |
| Cubee Mini-Centrifuge | RecenttecGenereach | R5-AQBD01aqbd | |
| MiSeq 600 cycle v3 | Illumina Inc. | MS-102-3003 | |
| MiSeq Sequencer | Illumina Inc. | SY-410-1003 |
Referenzen
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