Faire induite par la conjugaison Fluorescent pégylé Pseudo-particules virales de chimie Dibromomaleimide-disulfure
Summary
Nous présentons ici une procédure pour fonctionnaliser fluorescent les disulfures sur Qβ VLP avec dibromomaleimide. Nous décrivons Qβ expression et purification, la synthèse de molécules dibromomaleimide fonctionnalisés et la réaction de conjugaison entre dibromomaleimide et Qβ. La particule de conjugué fluorescente jaune qui en résulte peut être utilisée comme une sonde de fluorescence à l’intérieur des cellules.
Abstract
La récente hausse des Pseudo-particules virales (VLP) dans la recherche biomédicale et la recherche sur les matériaux peut être attribuée à leur facilité de biosynthèse, taille discrète, programmabilité génétique et biodégradabilité. Pendant qu’ils sont très susceptibles de réactions bioconjugaison permettant d’ajouter des ligands synthétiques sur leur surface, la bioconjugaison méthodologies sur ces capsides nés aqueux est relativement limitée. Pour faciliter la direction de la recherche de biomatériaux fonctionnels, réactions bioconjugaison non traditionnels doivent être considérées. La réaction décrite dans le présent protocole utilise dibromomaleimides pour introduire de nouvelles fonctionnalités dans le solvant disulfures exposées d’un PPV basés sur Qβ de bactériophage. En outre, le produit final est fluorescent, qui présente l’avantage de produire une sonde traçable in vitro à l’aide d’un jeu de filtres disponibles dans le commerce.
Introduction
À l’aide de taille nanométrique des capsides virales est devenue un domaine passionnant, qui vise à élargir le champ des applications dans la recherche biomédicale1,2,3. Inoculation exprimées Pseudo-particules virales (VLP) structurellement proviennent de virus, mais ils n’ont pas le matériel génétique viral initial, ce qui les rend non infectieuses protéinacées nanoparticules. Comme les caractéristiques de la surface sont génétiquement programmés et chaque capside est exprimée identiquement à ceux avant et après elle, il est possible de connaître l’emplacement et le nombre de chaînes de réactif latérales des acides aminés avec précision des atomes. Dans de nombreux cas, des surfaces extérieures et intérieures possèdent beaucoup de genres de résidus de solvant exposés d’acides aminés, qui peuvent facilement être fonctionnalisés par bioconjugaison réactions – réactions qui forment des liaisons covalentes entre une biomolécule et synthétique molécule4,5.
Bioconjugaison réactions aident biomolécules d’intérêt ont des fonctionnalités plus diversifiées de façon relativement simple. Molécules d’intérêt, tels que les médicaments thérapeutiques6, étiquettes fluorescentes7 et polymères8,9 peuvent être préalablement synthétisés et caractérisés avant ils sont attachés à la surface du PPV. Un PPV particulièrement courante en recherche biomédicale et recherche des biomatériaux a été le VLP basé sur Qβ de bactériophage, qui, comme inoculation exprimée, est un de capside icosaédrique nm 2810. Sites de réaction les plus communs sur Qβ sont des lysines par une large marge, bien que nous avons récemment communiqué la conjugaison réussie11 de dibromomaleimide composés pour les disulfures réduites qui tapissent les pores du Qβ par une réaction de Haidar-Baker. La réaction se produit avec un bon rendement et, tout aussi important, sans perdre la stabilité thermique des particules. Dans le même temps, cette réaction génère la fluorescence induite sur la conjugaison, qui peut être utilisée pour suivre l’absorption de ces particules dans des cellules. Dans ce travail, nous démontrons la conjugaison de polyéthylène glycol (PEG) sur la surface de Qβ grâce à la réaction de Haidar-Baker, qui se traduit par un fluorophore jaune vif. Ces particules puis peuvent être suivis que comme elles sont recueillies par les cellules. Le protocole ci-après aidera les chercheurs à générer de nouveau pégylé fluorescent nanoparticules protéiques basés sur Qβ, bien que ses principes sont applicables à l’un des nombreux autres PPV du contenant le solvants disulfures exposées.
Protocol
Representative Results
Discussion
Par rapport à la purification de protéines plus petite, une étape unique en épurant bactériophage Qβ est la centrifugation en gradient de saccharose. Après l’étape d’extraction chloroforme/n-butanol, Qβ est ensuite purifiée à l’aide de gradients de sucrose de 5 à 40 %. Lors de la centrifugation, les particules sont séparées selon leur taille. Grosses particules rendront dans la région de densité plus élevée, alors que les plus petites particules restent dans la région de densité plus faible. Qβ…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
B.E. reconnaît la National Science foundation (DMR-1654405) Cancer Prevention Research Institute of Texas (CPRIT) (RP170752s) pour leur soutien.
Materials
| LB Broth (Miller) | EMD Millipore | 1.10285.0500 | |
| Tryptone, Poweder | Research Products International | T60060-1000.0 | |
| Yeast Extract, Poweder | Research Products International | Y20020-1000.0 | |
| Anhydrous magnesium sulfate | P212121 | CI-06808-1KG | |
| Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS) | Fisher Scientific | S271-10 | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| Elga PURELAB Flex 3 Water Purification System | Fisher Scientific | 4474524 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | BP362-1 | |
| Potassium Phosphate Dibasic Anhydrous | Fisher Scientific | P288-500 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S25590B | |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818500 | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Sigma Aldrich | I6758-1G | |
| Fiberlite F10-4×1000 LEX rotor | Fisher Scientific | 096-041053 | |
| Ammonium Sulfate | P212121 | KW-0066-5KG | |
| Chloroform | Alfa Aesar | 32614-M6 | |
| 1-Butanol | Fisher Scientific | A399-4 | |
| SW 28 Ti Rotor, Swinging Bucket, Aluminum | Beckman Coulter | 342204: SW 28 Ti Rotor/ 342217: Bucket Set | |
| Type 70 Ti Rotor, Fixed Angle, Titanium, 8 x 39 mL, | Beckman Coulter | 337922 | |
| Coomassie (Bradford) Protein Assay | Fisher Scientific | PI23200 | |
| TRIS Hydrochloride | Research Products International | T60050-1000.0 | |
| Tetramethylethylenediamine | Alfa Aesar | J63734-AC | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma Aldrich | C4706-2G | |
| 2 3-Dibromomaleimide 97% | Sigma Aldrich | 553603-5G | |
| Polythylene Glycol | Alfa Aesar | 41561-22 | |
| Sodium Phosphate | Fisher Scientific | AC424375000 | |
| Acrylamide/bis-Acrylamide | P212121 | RP-A11310-500.0 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma Aldrich | L3771-100G | |
| Ammonium Persulfate | Fisher Scientific | BP179-100 | |
| FV3000 confocal laser scanning microscope | Olympus | FV3000 | |
| Labnet Revolver Adjustable Rotator | Thomas Scientific | 1190P25 | |
| 1000 mL Sorvall High Performance Bottle, PC, with Aluminum Cap | Thermo Scientific | 010-1459 | |
| Nalgene Centrifuge Bottles with Caps, Polypropylene Copolymer | Thermo Scientific | 3141-0250 | |
| Nunc Round-bottom tubes; 38 mL; PC | Thermo Scientific | 3117-0380 | |
| 2 L Narrow Mouth Erlenmeyer Flasks with Heavy Duty Rim | Pyrex | 4980-2L | |
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units | Millipore Sigma | UFC801024 | |
| M-110P Microfluidizer Materials Processor | Microfluidics | M-110P | |
| Nalgene High-Speed Polycarbonate Round Bottom Centrifuge Tubes | Thermo Scientific | 3117-0380PK | |
| Bottle, with Cap Assembly, Polycarbonate | Beckman Coulter | 41121703 | |
| Cylinder, Graduated – Polypropylene 250 mL | PolyLab | 80005 | |
| 533LS-E Series Steam Sterilizers | Getinge | 533LS-E | |
| TrueLine, Cell Culture Plate, Treated, PS, 96 Well, with Lid | LabSource | D36-313-CS | |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tube | Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| Microcentifuge Tube: 1.5mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| VWR Os-500 Orbital Shaker | VWR Scientifc Products | 14005-830 | |
| Tetra Handcast systems | Bio-Rad | 1658000FC | |
| Polypropylene, 250 mL | Beckman Coulter | 41121703 | |
| Spectrofluorometer NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | 3300 | |
| Long Needle | Hamilton | 7693 | |
| Exel International 5 to 6 cc Syringes Luer Lock | Fisher Scientific | 14-841-46 | |
| P1000 Pipetman | Gilson | F123602 | |
| P200 Pipetman | Gilson | F123601 | |
| P100 Pipetman | Gilson | F123615 | |
| P20 Pipetman | Gilson | F123600 | |
| P10 Pipetman | Gilson | F144802 | |
| Intel Weighing PM-100 Laboratory Classic High Precision Laboratory Balance | Intelligent Weighting Technology | IWT_PM100 | |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tube | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| 4–15% Mini-PROTEAN TGX Gel, 10 well, 50 µl | Bio-Rad | 456-1084 |
Referenzen
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