Делая спряжение индуцированной флуоресцентные Пегилированный вирус типа частиц по химии Dibromomaleimide дисульфида
Summary
Здесь мы представляем процедура дневно functionalize дисульфиды на Qβ VLP с dibromomaleimide. Мы описываем выражение Qβ и очистки, Синтез функционализированных dibromomaleimide молекул и спряжение реакции между dibromomaleimide и Qβ. Результате желтый флуоресцентный конъюгированных частиц может использоваться как флуоресценции зонда внутрь клетки.
Abstract
Недавний рост вирусоподобных частиц (VLP) в биомедицинских и материалы исследований можно отнести их простота биосинтез, дискретных размер, генетическое программирование и способность к биологическому разложению. Хотя они очень поддаются реакции bioconjugation для добавления синтетическими лигандами на их поверхность, диапазон в методологии bioconjugation на эти водные родился capsids относительно ограничен. Чтобы облегчить направление исследований функциональные биоматериалы, должны рассматриваться нетрадиционных bioconjugation реакций. Реакции, указанных в настоящем Протоколе использует dibromomaleimides ввести новую функциональность в растворителе, подвергаются дисульфидными облигаций VLP основе бактериофага Qβ. Кроме того конечный продукт флуоресцентные, которая имеет дополнительное преимущество генерации отслеживаются в vitro зонд, с помощью набора коммерчески доступных фильтров.
Introduction
С помощью нано размера вирусного capsids стала возбуждающего поля, которая направлена на расширение сферы применения биомедицинских исследований в1,2,3. Recombinantly выразил вирусоподобных частиц (VLP) структурно являются производными от вирусов, но им не хватает оригинальных вирусного генетического материала, делая их неинфекционных белковых наночастиц. Как особенности поверхности генетически запрограммирован и каждый капсид выражается одинаково на те до и после него, это можно узнать местонахождение и количество реактивных боковых цепей аминокислот с атомистическим точностью. Во многих случаях наружных и внутренних поверхностей обладают многие виды растворителей подвергаются аминокислотных остатков, которые реально могут быть функционализированных через bioconjugation реакции – реакции, которые образуют ковалентные связи между биомолекулы и синтетические молекула4,5.
Bioconjugation реакции помогают биомолекул интерес у более разнообразных функций в относительно простой моды. Молекулы интереса, таких как лечебных препаратов6, флуоресцентные метки7 и полимеров8,9 могут быть предварительно синтезируется и характеризуется, прежде чем они крепятся на поверхности VLP. Особенно распространены VLP в биомедицинских и биоматериалов исследования был ВЛП, основанные на бактериофага Qβ, который, как recombinantly выраженным, является 28 Нм икосаэдра вирусного капсида10. Наиболее распространенные реакции сайты на Qβ являются lysines с большим отрывом, хотя недавно мы общались успешного сопряжения11 dibromomaleimide соединений для снижения дисульфиды, которые выстилают поры Qβ через Haddleton-Бейкер реакции. Реакция идёт с хорошим доходность и, что не менее важно, без потери термостабильности частиц. В то же время эта реакция генерирует спряжение индуцированной флуоресценции, который может использоваться для отслеживания поглощение этих частиц в клетки. В этой работе мы демонстрируем спряжение полиэтиленгликоля (PEG) на поверхность Qβ через Haddleton-Бейкер реакцию, которая приводит яркий желтый Флюорофор. Эти частицы затем могут быть отслежены, как они принимаются клетки. Протокол здесь поможет генерировать новые люминесцентные Пегилированный белковых наночастиц на основе Qβ, хотя его принципы применяются к одному из многих других VLP, содержащие растворитель подвергаются дисульфиды исследователей.
Protocol
Representative Results
Discussion
По сравнению с небольших очищение протеина, уникальный шаг в очищающий бактериофага Qβ — сахароза градиентного центрифугирования. После извлечения хлороформ/н бутанолом шага Qβ далее очищается с помощью 5-40% сахарозы градиентов. Во время центрифугирования частицы разделяются на их раз…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
J.J.G. признает Национальный научный фонд (DMR-1654405) и Институт исследования профилактики рака штата Техас (CPRIT) (RP170752s) за их поддержку.
Materials
| LB Broth (Miller) | EMD Millipore | 1.10285.0500 | |
| Tryptone, Poweder | Research Products International | T60060-1000.0 | |
| Yeast Extract, Poweder | Research Products International | Y20020-1000.0 | |
| Anhydrous magnesium sulfate | P212121 | CI-06808-1KG | |
| Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS) | Fisher Scientific | S271-10 | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| Elga PURELAB Flex 3 Water Purification System | Fisher Scientific | 4474524 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | BP362-1 | |
| Potassium Phosphate Dibasic Anhydrous | Fisher Scientific | P288-500 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S25590B | |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818500 | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Sigma Aldrich | I6758-1G | |
| Fiberlite F10-4×1000 LEX rotor | Fisher Scientific | 096-041053 | |
| Ammonium Sulfate | P212121 | KW-0066-5KG | |
| Chloroform | Alfa Aesar | 32614-M6 | |
| 1-Butanol | Fisher Scientific | A399-4 | |
| SW 28 Ti Rotor, Swinging Bucket, Aluminum | Beckman Coulter | 342204: SW 28 Ti Rotor/ 342217: Bucket Set | |
| Type 70 Ti Rotor, Fixed Angle, Titanium, 8 x 39 mL, | Beckman Coulter | 337922 | |
| Coomassie (Bradford) Protein Assay | Fisher Scientific | PI23200 | |
| TRIS Hydrochloride | Research Products International | T60050-1000.0 | |
| Tetramethylethylenediamine | Alfa Aesar | J63734-AC | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma Aldrich | C4706-2G | |
| 2 3-Dibromomaleimide 97% | Sigma Aldrich | 553603-5G | |
| Polythylene Glycol | Alfa Aesar | 41561-22 | |
| Sodium Phosphate | Fisher Scientific | AC424375000 | |
| Acrylamide/bis-Acrylamide | P212121 | RP-A11310-500.0 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma Aldrich | L3771-100G | |
| Ammonium Persulfate | Fisher Scientific | BP179-100 | |
| FV3000 confocal laser scanning microscope | Olympus | FV3000 | |
| Labnet Revolver Adjustable Rotator | Thomas Scientific | 1190P25 | |
| 1000 mL Sorvall High Performance Bottle, PC, with Aluminum Cap | Thermo Scientific | 010-1459 | |
| Nalgene Centrifuge Bottles with Caps, Polypropylene Copolymer | Thermo Scientific | 3141-0250 | |
| Nunc Round-bottom tubes; 38 mL; PC | Thermo Scientific | 3117-0380 | |
| 2 L Narrow Mouth Erlenmeyer Flasks with Heavy Duty Rim | Pyrex | 4980-2L | |
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units | Millipore Sigma | UFC801024 | |
| M-110P Microfluidizer Materials Processor | Microfluidics | M-110P | |
| Nalgene High-Speed Polycarbonate Round Bottom Centrifuge Tubes | Thermo Scientific | 3117-0380PK | |
| Bottle, with Cap Assembly, Polycarbonate | Beckman Coulter | 41121703 | |
| Cylinder, Graduated – Polypropylene 250 mL | PolyLab | 80005 | |
| 533LS-E Series Steam Sterilizers | Getinge | 533LS-E | |
| TrueLine, Cell Culture Plate, Treated, PS, 96 Well, with Lid | LabSource | D36-313-CS | |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tube | Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| Microcentifuge Tube: 1.5mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| VWR Os-500 Orbital Shaker | VWR Scientifc Products | 14005-830 | |
| Tetra Handcast systems | Bio-Rad | 1658000FC | |
| Polypropylene, 250 mL | Beckman Coulter | 41121703 | |
| Spectrofluorometer NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | 3300 | |
| Long Needle | Hamilton | 7693 | |
| Exel International 5 to 6 cc Syringes Luer Lock | Fisher Scientific | 14-841-46 | |
| P1000 Pipetman | Gilson | F123602 | |
| P200 Pipetman | Gilson | F123601 | |
| P100 Pipetman | Gilson | F123615 | |
| P20 Pipetman | Gilson | F123600 | |
| P10 Pipetman | Gilson | F144802 | |
| Intel Weighing PM-100 Laboratory Classic High Precision Laboratory Balance | Intelligent Weighting Technology | IWT_PM100 | |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tube | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| 4–15% Mini-PROTEAN TGX Gel, 10 well, 50 µl | Bio-Rad | 456-1084 |
Referenzen
- Pokorski, J., Breitenkamp, K., Liepold, L., Qazi, S., Finn, M. G. Functional Virus-Based Polymer-Protein Nanoparticles by Atom Transfer Radical Polymerization. J. Am. Chem. Soc. 133 (24), 9242-9245 (2011).
- Capehart, S., Coylet, M., Glasgow, J., Francis, M. Controlled Integration of Gold Nanoparticles and Organic Fluorophores Using Synthetically Modified MS2 Viral Capsids. J. Am. Chem. Soc. 135 (8), 3011-3016 (2013).
- Li, S., et al. Template-Directed Synthesis of Porous and Protective Core-Shell Bionanoparticles. Angew. Chem. Int. Ed. 55 (36), 10691-10696 (2016).
- Chen, Z., Li, N., Li, S., Dharmarwardana, M., Schlimme, A., Gassensmith, J. J. Viral Chemistry: The Chemical Functionalization of Viral Architectures to Create New Technology. WIREs. Nanomed. Nanobiotechnol. 8 (4), 512-534 (2015).
- Chalker, J. M., Bernardes, G. J. L., Lin, Y. A., Davis, B. G. Chemical modification of proteins at cysteine: opportunities in chemistry and biology. Chem. – Asian J. 4 (5), 630-640 (2009).
- Le, D. H., Lee, K. L., Shukla, S., Commandeur, U., Steinmetz, N. F. Potato Virus X, a Filamentous Plant Viral Nanoparticle for Doxorubicin Delivery in Cancer Therapy. Nanoscale. 9 (6), 2348-2357 (2017).
- Chen, L., Wu, Y., Yuan, L., Wang, Q. Virus-templated FRET Platform for the Rational Design of Ratiometric Fluorescent Nanosensors. Chem. Comm. 51 (50), 10190-10193 (2015).
- Lee, P., et al. Polymer Structure and Conformation Alter the Antigenicity of Virus-like Particle-Polymer Conjugates. J. Am. Chem. Soc. 139 (9), 3312-3315 (2017).
- Zhang, X., et al. Polymer-Protein Core-Shell Nanoparticles for Enhanced Antigen Immunogenicity. ACS Macro Lett. 6 (4), 442-446 (2017).
- Brown, S. D., Fielder, J. D., Finn, M. G. Assembly of Hybrid Bacteriophage Qbeta virus-like particles. Biochemie. 48 (47), 11155-11157 (2009).
- Chen, Z., et al. Fluorescent Functionalization across Quaternary Structure in a Virus- like Particle. Bioconjugate Chem. 28 (9), 2277-2283 (2017).
- . Pouring LB Agar Plates Available from: https://www.addgene.org/protocols/pouring-lb-agar-plates/ (2016)
- Smith, M., et al. Protein Modification, Bioconjugation, and Disulfide Bridging Using Bromomaleimides. J. Am. Chem. Soc. 132 (6), 1960-1965 (2010).
- Castaneda, L., et al. A Mild Synthesis of N-functionalised Bromomaleimides, Thiomaleimides and Bromopyridazinediones. Tetrahedron Lett. 54 (27), 3493-3495 (2013).
- Fiedler, J., et al. Engineered Mutations Change the Structure and Stability of a Virus- Like Particle. Biomacromolecules. 13 (8), 2339-2348 (2012).
- Manzenrieder, F., Luxenhofer, R., Retzlaff, M., Jordan, R., Finn, M. G. Stabilization of Virus-like Particles with Poly(2-oxazoline)s. Angew. Chem. Int. Ed. 50 (11), 2601-2605 (2011).
- Chen, Z., Li, N., Chen, L., Lee, J., Gassensmith, J. J. Dual Functionalized Bacteriophage Qβ as a Photocaged Drug Carrier. Small. 12 (33), 4563-4571 (2016).
