Formazione di Biofilm orali su differenti materiali per impianti dentali
Summary
Qui, presentiamo un protocollo per la valutazione di biofilm orali su materiali di titanio e ossido di zirconio per i pilastri di protesi dentarie, compresa l’analisi di attuabilità delle cellule batteriche e caratteristiche morfologiche. Un modello in situ associato con tecniche di microscopia potente viene utilizzato per l’analisi di biofilm orale.
Abstract
Impianti dentali e loro componenti protesici sono inclini a colonizzazione batterica e la formazione di biofilm. L’utilizzo di materiali che fornisce bassa adesione microbica può ridurre la prevalenza e la progressione di malattie perimplantari. In considerazione l’ambiente orale complessità e oral biofilm eterogeneità, microscopia sono necessarie tecniche che consentono un’analisi di biofilm delle superfici dei denti e materiali dentali. Questo articolo descrive una serie di protocolli implementati per confrontare la formazione di biofilm orali su titanio e materiali ceramici per pilastri protesici, come pure i metodi coinvolti nelle analisi di biofilm orale a livello morfologico e cellulare. Il modello in situ per valutare la formazione di biofilm orali su materiali di titanio e ossido di zirconio per i pilastri di protesi dentale come descritto in questo studio fornisce una buona conservazione del biofilm 48h, dimostrando in tal modo adeguatezza metodologica. La microscopia multifotonica permette l’analisi di un rappresentante di zona del biofilm formato sui materiali di prova. Inoltre, l’uso di fluorofori e l’elaborazione delle immagini usando la microscopia multifotonica permette l’analisi della redditività batterica in una popolazione molto eterogenea di microrganismi. La preparazione di campioni biologici per microscopia elettronica promuove la conservazione strutturale del biofilm, immagini con una buona risoluzione e senza artefatti.
Introduction
Biofilm batterici sono complesse, funzionalmente e strutturalmente organizzato comunità microbiche, caratterizzato da una diversità di specie microbiche che sintetizzano un polimero extracellulare, biologicamente attivo matrix1,2. L’adesione batterica alle superfici di tipo biotiche o abiotiche è preceduto da una formazione della pellicola acquisita, costituita principalmente da glicoproteine salivari1,3,4. Deboli interazioni fisico-chimiche tra i microrganismi e la pellicola sono inizialmente stabilite e seguite da forti interazioni tra adesine batteriche e recettori glicoproteici della pellicola acquisita. Diversità microbica aumenta gradualmente attraverso la coaggregation dei colonizzatori secondarie ai recettori dei batteri già associate, formando una comunità multispecifica1,3,4, 5.
Omeostasi del microbiota orale e il suo rapporto simbiotico con l’host è importante nel mantenimento della salute orale. La disbiosi all’interno del biofilm orale possono aumentare il rischio per lo sviluppo di carie e malattia parodontale2,5. Gli studi clinici dimostrano una relazione di causa-effetto tra l’accumulo del biofilm su denti o impianti dentali e lo sviluppo di gengivite o peri-implantare mucosite6,7. La progressione del processo infiammatorio porta alla perimplantite e la conseguente perdita dell’ impianto8.
Impianti dentali e loro componenti protesici sono inclini a colonizzazione batterica e la formazione di biofilm9. L’uso di materiali con una composizione chimica e la topografia di superficie che fornisce bassa adesione microbica può ridurre la prevalenza e la progressione di malattie perimplantari9,10. Il titanio è il materiale più utilizzato per la fabbricazione di pilastri protesici per protesi; Tuttavia, i materiali ceramici sono stati recentemente introdotti e stanno guadagnando popolarità come alternativa al titanio a causa della loro proprietà estetiche e biocompatibilità11,12. Inoltre importante, materiali ceramici sono stati associati con un potenziale presumibilmente ridotto ad aderire ai microrganismi, principalmente a causa di loro rugosità superficiale, bagnabilità ed energia libera di superficie10,13.
Studi in vitro hanno contribuito a progressi significativi nella comprensione dell’adesione microbica al moncone protesico superfici9,14,15,16,17. Tuttavia, l’ambiente dinamico della cavità orale, caratterizzata dalla sua temperatura variabile e il pH e la disponibilità di nutrienti, oltre che dalla presenza di forze di taglio, non è riproducibile in vitro protocolli sperimentali18, 19. Per ovviare a questo problema, un’alternativa è l’utilizzo di modelli in situ di formazione del biofilm, che vantaggiosamente conserva la sua struttura tridimensionale per ex vivo analisi10,20, 21 , 22 , 23 , 24.
L’analisi della complessa struttura del biofilm formata su substrati orale richiede l’utilizzo di tecniche di microscopia in grado di visualizzare otticamente densa materia25. Microscopia a scansione laser di Multiphoton è una moderna opzione per biofilm analisi strutturale26. È caratterizzato dall’uso di ottica non lineare con una fonte di illuminazione vicino alla lunghezza d’onda infrarossa, pulsato a femtosecondi27. Questo metodo è indicato per l’acquisizione di immagini di autofluorescence materiali o segnato da fluorofori, oltre alle immagini generate da segnali ottici non-lineari, derivati da un fenomeno noto come generazione di seconda armonica. Tra i vantaggi della microscopia multifotonica sono la profondità di grande immagine ottenuta con danno minimo delle cellule causato dall’intensità della luce di eccitazione27.
Per un’analisi di attuabilità del biofilm su superfici abiotiche da microscopia multifotonica, l’uso di acido nucleico fluorescente tinture con differenti caratteristiche spettrali e una capacità di penetrazione nelle cellule batteriche è richiesto28. Fluorophores SYTO9 (verde-fluorescente) e ioduro di propidio (rosso fluorescente) può essere utilizzati per una differenziazione visiva tra batteri vivi e morti28,29,30. Ioduro di propidio penetra soli batteri con membrane danneggiate, mentre SYTO9 entra nelle cellule batteriche con una membrana intatta e compromessa. Quando entrambi i coloranti sono presenti all’interno di una cella, ioduro di propidio sposta SYTO9, contrassegnandolo rosso28,30e ha una maggiore affinità per gli acidi nucleici.
In considerazione l’ambiente orale complessità e oral biofilm eterogeneità, microscopia sono necessarie tecniche che consentono l’analisi di biofilm delle superfici dei denti e materiali dentali. Questo articolo descrive una serie di protocolli implementati per confrontare la formazione di biofilm orali su titanio e materiali ceramici per pilastri protesici, come pure i metodi coinvolti nelle analisi di biofilm orale a livello morfologico e cellulare.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo descritto in questo studio è stato sviluppato per valutare la formazione di biofilm su materiali di titanio e ossido di zirconio per pilastri protesici, compresa l’analisi di attuabilità delle cellule batteriche e caratteristiche morfologiche. Per ottenere questo risultato, è stato progettato un modello di in situ di formazione del biofilm, che consiste di un dispositivo intraorale in grado di ospitare campioni di prova materiali e tenerli esposta all’ambiente orale dinamico per 48 h. Il disposi…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano José Augusto Maulin dal laboratorio di microscopia Multiuser (scuola di medicina di Ribeirão Preto) per la sua generosa assistenza con EDS e SEM analisi e Hermano Teixeira Machado per la sua generosa assistenza tecnica nell’edizione dei video.
Materials
| Hydrogum 5 | Zhermack Dental | C302070 | |
| Durone IV | Dentsply | 17130500002 | |
| NiCr wire | Morelli | 55.01.070 | |
| JET auto polymerizing acrylic | Clássico | ||
| Dental wax | Clássico | ||
| Pressure pot | Essencedental | ||
| Sandpapers 600 grit | NORTON | T216 | |
| Sandpapers 1200 grit | NORTON | T401 | |
| Sandpapers 2000 grit | NORTON | T402 | |
| Metallographic Polishing Machine | Arotec | ||
| Isopropyl alcohol | SIGMA-ALDRICH | W292907 | |
| Hot melt adhesive | TECSIL | PAH M20017 | |
| Filmtracer LIVE/DEAD Biofilm Viability Kit | Invitrogen | L10316 | |
| Pipette Tips, 10 µL | KASVI | K8-10 | |
| Pipette Tips, 1,000 µL | KASVI | K8-1000B | |
| 24-well plate | KASVI | K12-024 | |
| Glass Bottom Dish | Thermo Scientific | 150680 | |
| AxioObserver inverted microscope | ZEISS | ||
| Chameleon vision ii laser | Coherent | ||
| Objective EC Plan-Neofluar 40x/1.30 Oil DIC | ZEISS | 440452-9903-000 | |
| SDD sensors – X-Max 20mm² | Oxford Instruments | ||
| Glutaraldehyde solution | SIGMA-ALDRICH | G5882 | |
| Sodium cacodylate Buffer | SIGMA-ALDRICH | 97068 | |
| Osmium tetroxide | SIGMA-ALDRICH | 201030 | |
| Na2HPO4 | SIGMA-ALDRICH | S9638 | Used for preparation of phosphate buffered saline |
| KH2PO4 | SIGMA-ALDRICH | P9791 | |
| NaCl | MERK | 1.06404 | |
| Kcl | SIGMA-ALDRICH | P9333 | |
| Ethanol absolute for analysis EMSURE | MERK | 1.00983 | |
| CPD 030 Critical Point Dryer | BAL-TEC | ||
| JSM-6610 Series Scanning Electron Microscope | JEOL | ||
| SCD 050 Sputter Coater | BAL-TEC |
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