Formación de Biofilm oral sobre diferentes materiales para implantes dentales
Summary
Aquí, presentamos un protocolo para evaluar la formación de biofilm oral sobre materiales de titanio y zirconio para pilares de prótesis dental, incluyendo el análisis de la viabilidad de las células bacterianas y características morfológicas. Un modelo en situ asociado con técnicas de microscopía de gran alcance se utiliza para el análisis de biofilm oral.
Abstract
Implantes dentales y sus componentes protésicos son propensos a la colonización bacteriana y formación de biopelículas. El uso de materiales que proporciona la adherencia microbiana baja puede reducir la prevalencia y progresión de enfermedades peri-implante. Teniendo en cuenta el medio ambiente oral oral y complejidad biofilm heterogeneidad, microscopia se necesitan técnicas que puede hacer un análisis de biofilm de las superficies de los dientes y materiales dentales. Este artículo describe una serie de protocolos implementados para comparar la formación de biofilm oral sobre titanio y materiales cerámicos de aditamentos protésicos, así como los métodos de análisis de biopelículas orales a nivel morfológico y celular. El modelo en situ para evaluar la formación de biofilm oral sobre materiales de titanio y zirconio para pilares de prótesis dentales como se describe en este estudio ofrece una satisfactoria preservación de la biopelícula de 48 h, lo que demuestra la adecuación metodológica. Microscopía multifotón permite el análisis de un representante del área de la biopelícula formada en la prueba de materiales. Además, el uso de fluoróforos y el procesamiento de las imágenes mediante microscopía multifotón permiten el análisis de la viabilidad bacteriana en una población muy heterogénea de microorganismos. La preparación de muestras biológicas para microscopia electrónica promueve la preservación estructural de biofilm, imágenes con buena resolución y sin artefactos.
Introduction
Biofilms bacterianos son complejos, funcionalmente y estructuralmente organizada las comunidades microbianas, caracterizado por una diversidad de especies microbianas que sintetizan una matriz extracelular polímero biológicamente activo1,2. La adhesión bacteriana a superficies bióticas o abióticas es precedida por una formación de la película adquirida, que consiste en principalmente glicoproteínas salivales1,3,4. Débiles interacciones fisicoquímicas entre los microorganismos y la película son inicialmente establecidas y seguidas por fuertes interacciones adhesinas bacterianas y receptores de la glicoproteína de la película adquirida. Diversidad microbiana aumenta gradualmente a través de la coaggregation de los colonizadores secundarios a los receptores de las bacterias ya atados, formando una comunidad de especies1,3,4, 5.
Homeostasis de la microbiota oral y su relación simbiótica con el hospedero es importante en el mantenimiento de la salud oral. La disbiosis dentro de los biofilms orales pueden aumentar el riesgo para el desarrollo de caries y enfermedad periodontal2,5. Estudios clínicos demuestran una relación de causa y efecto entre la acumulación de biofilm en los dientes o implantes dentales y el desarrollo de gingivitis o peri-implante mucositis6,7. La progresión del proceso inflamatorio conduce a peri-implantitis y la consiguiente pérdida del implante8.
Implantes dentales y sus componentes protésicos son propensos a la colonización bacteriana y biofilm formación9. El uso de materiales con una composición química y la topografía de la superficie que proporciona la adherencia microbiana baja puede reducir la prevalencia y progresión de peri-implante enfermedades9,10. El titanio es el material más utilizado para la fabricación de aditamentos protésicos para implantes; sin embargo, los materiales cerámicos fueron introducidos recientemente y están ganando popularidad como una alternativa al titanio debido a sus propiedades estéticas y biocompatibilidad11,12. También importante, materiales de cerámica se han asociado con un potencial supuestamente reducido a adherirse a los microorganismos, principalmente debido a su rugosidad, la humectabilidad y la energía libre superficial10,13.
Estudios in vitro han contribuido a importantes avances en la comprensión de la adherencia microbiana a pilar protésico superficies9,14,15,16,17. Sin embargo, el dinámico ambiente de la cavidad oral, caracterizado por sus diversos temperatura y pH y la disponibilidad de nutrientes, así como por la presencia de las fuerzas de corte, no es reproducible en vitro protocolos experimentales18, 19. Para superar este problema, una alternativa es el uso de modelos en situ de la formación de biofilm, que ventajosamente conserva su estructura tridimensional para ex vivo análisis10,20, 21 , 22 , 23 , 24.
El análisis de la compleja estructura del biofilm formado sobre sustratos orales requiere el uso de técnicas de microscopía de ópticamente denso materia25. Microscopía multifotón láser es una opción moderna para biofilm análisis estructural26. Se caracteriza por el uso de la óptica no lineal con una fuente de iluminación cerca de la longitud de onda infrarroja pulsada a femtosegundos27. Este método está indicado para la adquisición de imágenes de Autofluorescencia o materiales marcados por fluoróforos, además de imágenes generadas por señales ópticas no lineales derivadas de un fenómeno conocido como segunda generación armónica. Entre las ventajas de la microscopía multifotón es la profundidad de la imagen obtenida con células mínimo daño causado por la intensidad de la luz de excitación27.
Para un análisis de viabilidad de biopelícula en superficies abióticas por microscopía multifotón, el uso de ácido nucleico fluorescente tiñe con diferentes características espectrales y una capacidad de penetración en las células bacterianas es necesario28. Fluorophores SYTO9 (verde fluorescente) y yoduro de propidio (rojo fluorescente) pueden ser utilizados para una diferenciación visual entre bacterias vivas y muertas28,29,30. Yoduro de propidio penetra solamente bacterias con membranas dañadas, mientras que SYTO9 entra en las células bacterianas con una membrana intacta y comprometida. Cuando ambos colorantes están presentes dentro de una celda, yoduro de propidio tiene una mayor afinidad por los ácidos nucleicos y desplaza SYTO9, marca rojo28,30.
Teniendo en cuenta el medio ambiente oral oral y complejidad biofilm heterogeneidad, microscopia se necesitan técnicas que permite el análisis de la biopelícula de las superficies de los dientes y materiales dentales. Este artículo describe una serie de protocolos implementados para comparar la formación de biofilm oral sobre titanio y materiales cerámicos de aditamentos protésicos, así como los métodos de análisis de biopelículas orales a nivel morfológico y celular.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo descrito en este estudio se desarrolló para evaluar la formación de biopelículas sobre materiales de titanio y zirconio para aditamentos protésicos, incluyendo el análisis de la viabilidad de la célula bacteriana y características morfológicas. Para lograr esto, se diseñó un modelo en situ de la formación de biopelículas, que consta de un dispositivo intraoral capaces de acomodar las muestras de los materiales de prueba y mantenerlos expuestos al medio oral dinámico durante 48 h. El dis…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen José Augusto Maulin del laboratorio de microscopía multiusuario (Facultad de medicina de Ribeirão Preto) por su ayuda generosa con el EDS y SEM análisis y Hermano Teixeira Machado por su generosa asistencia técnica en la edición de vídeo.
Materials
| Hydrogum 5 | Zhermack Dental | C302070 | |
| Durone IV | Dentsply | 17130500002 | |
| NiCr wire | Morelli | 55.01.070 | |
| JET auto polymerizing acrylic | Clássico | ||
| Dental wax | Clássico | ||
| Pressure pot | Essencedental | ||
| Sandpapers 600 grit | NORTON | T216 | |
| Sandpapers 1200 grit | NORTON | T401 | |
| Sandpapers 2000 grit | NORTON | T402 | |
| Metallographic Polishing Machine | Arotec | ||
| Isopropyl alcohol | SIGMA-ALDRICH | W292907 | |
| Hot melt adhesive | TECSIL | PAH M20017 | |
| Filmtracer LIVE/DEAD Biofilm Viability Kit | Invitrogen | L10316 | |
| Pipette Tips, 10 µL | KASVI | K8-10 | |
| Pipette Tips, 1,000 µL | KASVI | K8-1000B | |
| 24-well plate | KASVI | K12-024 | |
| Glass Bottom Dish | Thermo Scientific | 150680 | |
| AxioObserver inverted microscope | ZEISS | ||
| Chameleon vision ii laser | Coherent | ||
| Objective EC Plan-Neofluar 40x/1.30 Oil DIC | ZEISS | 440452-9903-000 | |
| SDD sensors – X-Max 20mm² | Oxford Instruments | ||
| Glutaraldehyde solution | SIGMA-ALDRICH | G5882 | |
| Sodium cacodylate Buffer | SIGMA-ALDRICH | 97068 | |
| Osmium tetroxide | SIGMA-ALDRICH | 201030 | |
| Na2HPO4 | SIGMA-ALDRICH | S9638 | Used for preparation of phosphate buffered saline |
| KH2PO4 | SIGMA-ALDRICH | P9791 | |
| NaCl | MERK | 1.06404 | |
| Kcl | SIGMA-ALDRICH | P9333 | |
| Ethanol absolute for analysis EMSURE | MERK | 1.00983 | |
| CPD 030 Critical Point Dryer | BAL-TEC | ||
| JSM-6610 Series Scanning Electron Microscope | JEOL | ||
| SCD 050 Sputter Coater | BAL-TEC |
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