Revisión y análisis de la reparación de ADN usando análisis de extensión de un solo nucleótido y MALDI-TOF espectrometría de masa
Summary
Se desarrolló un método no etiquetados, radio-isotópico para la corrección de la polimerasa de la DNA y un ensayo de reparación del ADN mediante espectrometría de masas MALDI-TOF alta resolución y una estrategia de extensión de un solo nucleótido. El ensayo demostró ser muy específico, simple, rápido y fácil de realizar para corregir y reparar los parches menor 9 nucleótidos.
Abstract
El mantenimiento del genoma y su fiel replicación es fundamental para conservar la información genética. Para evaluar la replicación de alta fidelidad, hemos desarrollado un simple no etiquetados y método radio-isotópica con una ionización de desorción láser asistida por matriz (MALDI-TOF) de tiempo de vuelo total análisis de espectrometría (MS) para un estudio de revisión. Aquí, una polimerasa de ADN [por ejemplo, el fragmento de Klenow (KF) de polimerasa de la DNA de Escherichia coli I (pol I) en este estudio] en presencia de los cuatro trifosfatos de dideoxyribonucleotide se utiliza para procesar un duplex cartilla-plantilla. La cartilla es entonces revisado/ampliado y sometida a MS de MALDI-TOF. Los productos se distinguen por el cambio de masa de la cartilla a las variaciones de un solo nucleótido. Lo importante, una corrección también puede ser determinado por desajustes individuales internos, aunque a diferentes eficiencias. Situado en 2-4-nucleótidos (nt) desde el extremo 3′ de desajustes fueron eficientemente corregido por pol I, y un desajuste en el 5 nt de la terminal de cartilla demostró solamente una corrección parcial. Sin corrección se produjo de desajustes internos ubicados en 6-9 nt desde el extremo 3′ del primer. Este método puede aplicarse también al análisis de reparación de ADN (por ejemplo, evaluando una reparación de la lesión de base de sustratos para la vía de reparación endo V). Cartillas que contienen 3′ penúltimo deoxyinosine (dI) lesiones podrían corregirse por pol I. De hecho, penúltima T-I, G-I y A-sustratos tuvieron su último 2 nucleótidos que contienen dI suprimido por pol I antes de agregar un correcta ddN 5′-monofosfato (ddNMP) al penúltimo C-desajustes fueron tolerados por pol I, permitiendo que la cartilla para extenderse sin reparación, demostrando que la sensibilidad y la resolución de la Sra. de ensayo para medir la reparación del ADN.
Introduction
Las funciones de corrección de polimerasas de la DNA durante la replicación del ADN son esenciales para asegurar la alta fidelidad de la información genética que debe ser transferido a la progenie1,2,3,4, 5,6,7. Ser capaz de evaluar las contribuciones de polimerasa corrección situados aclara los mecanismos de salvaguarda de la estabilidad genética.
Etiquetado de radioisótopo y ensayos de gel en combinación con análisis densitométricos del fósforo de8,9,10 autoradiograms tradicionalmente se han utilizado para detectar actividad de corrección de ADN polimerasas. Mientras que funcional, estos ensayos son laboriosos, costosos y no susceptibles de formatos de alto rendimiento. Además, radioisótopos sufren problemas de seguridad, incluyendo la eliminación de residuos. Por otra parte, actividades de corrección han sido analizadas por técnicas fluorométrica. Por ejemplo, 2-aminopurina (AP-2) puede ser incorporado en productos de la extensión durante en vitro polimerasa corrección ensayos para producir una señal fluorescente11,12. Lamentablemente, estos enfoques sufren de una baja especificidad, ya que 2-AP puede emparejarse con la timina y citosina. Enfoques más recientes incluyen una sensible basada en G-quadruplex luminiscente encendido Sonda para una polimerasa 3′ – 5′ exonucleasa ensayo13 así como una sonda fluorescente etiquetado individualmente para una polimerasa corrección ensayo que supera algunas de las inconvenientes ya mencionados14. Entusiasmo por estos métodos fluorométrico es disminuido debido a la necesidad de que el etiquetado específico de substratos DNA.
Por el contrario, se ha empleado un MALDI-TOF MS para el análisis de ADN en el ensayo de punta, donde las reacciones de extensión de la cartilla con 4 ddNTPs pueden utilizarse para identificar polimorfismos en un locus dado15,16,17 y ha sido adoptado ampliamente en aplicaciones clínicas para la detección de la mutación y diagnósticos de cáncer de18. Usando estos principios básicos, hemos creado un ensayo libre de etiqueta para la determinación en vitro de ADN polimerasa corrección actividad aprovechando la alta resolución, alta especificidad y alto rendimiento potencial de uso de MALDI-TOF MS. E. coli DNA polimerasa I Klenow fragmento como enzima modelo, dideoxyribonucleotide trifosfatos (ddNTPs) como sustratos pueden tomar una “instantánea” de revisión de productos después de un nucleótido simple extensión mediante MALDI-TOF MS (figura 1).
Además, este método fue desarrollado también para un ensayo de reparación del ADN en cartillas que contienen 3′ penúltimo dI las lesiones son sometidas a un pol que reparar ensayo que imita endo V Mellado reparación intermedios. Mientras que no completamente entendida, la vía de reparación endo V es el único sistema de reparación a emplear la pol I corrección actividad exonucleasa por lesión supresión19,20. Mediante MALDI-TOF MS, mostramos un parche de reparación claramente definidos donde dI puede ser suprimido por pol que cuando ocurre en los 2 últimos nt de la cartilla antes de agregar el nucleótido correcto complementa.
Para el estudio de revisión y reparación del ADN, este método es más rápido y menos laborioso que los anteriores métodos y proporciona información adicional hacia el mecanismo y función.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este estudio describe un ensayo de actividad corrección paso a paso por el instrumento comercial solicitado (ver la Tabla de materiales) utilizando MS de MALDI-TOF. Las principales ventajas son que la cartilla y la plantilla son etiqueta gratuito y fácil de realizar, lo que permite una mayor flexibilidad en el diseño de experimentos. Una corriente-cal completa procesamiento de 30 corrección pruebas llevaría h 4, incluyendo 3 h para realizar manualmente las corrección de las reacciones y su limpieza…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos la instalación integrada de base de NCFPB genómica funcional (Taipei, Taiwan) y el laboratorio de farmacogenómica de la NRPB (Taipei, Taiwán) por su apoyo técnico. Este trabajo fue apoyado por becas de investigación de la Fundación de salud de Taiwán (L-I.L.) y el Ministerio de ciencia y tecnología, Taipei, Taiwán, ROC [más 105-2320-B-002-047] para Hu Yao Wei, [más 105-2628-B-002-051-MY3] Kang-Yi Su y [ Most-105-2320-B-002-051-MY3] para en Liang Lin.
Materials
| Oligonucleotides | Mission Biotech (Taiwan) | ||
| phosphorothioate modified oligonucleotides | Integrated DNA Technologies (Taiwan) | ||
| DNA polymerase I, Large (Klenow) Fragment | New England Biolabs, MA | M0210L | |
| Klenow fragment (3'→5' exo-) | New England Biolabs, MA | M0212L | |
| NEBuffer 2.1 (10X) | New England Biolabs, MA | B7202S | |
| 2', 3' ddATP | Trilink Biotechnologies, CA | N4001 | |
| 2', 3' ddGTP | Trilink Biotechnologies, CA | N4002 | |
| 2', 3' ddTTP | Trilink Biotechnologies, CA | N4004 | |
| 2', 3' ddCTP | Trilink Biotechnologies, CA | N4005 | |
| dATP, dGTP, dCTP, dTTP set | Clubio, Taiwan | CB-R0315 | |
| SpectroCHIP array | Agena Bioscience, CA | #01509 | |
| MassARRAY | Agena Bioscience, CA | ||
| Typer 4.0 software | Agena Bioscience, CA | #10145 | |
| Clean Resin Tool Kit | Agena Bioscience, CA | #08040 |
Referenzen
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