مقايسة تنحية نازعة لاكتات — طريقة بسيطة وموثوق بها لتحديد النشاط تنحية أوتوفاجيك الأكبر في خلايا الثدييات
Summary
ويرد هنا بروتوكول بسيط وتم التحقق من صحتها جيدا لقياس النشاط تنحية أوتوفاجيك الأكبر في خلايا الثدييات. الأسلوب يستند على قياس نسبة اللاكتات نازعة (رابطة حقوق الإنسان) في سيديمينتابل خلية الكسور مقارنة بإجمالي المستويات الخلوية في رابطة حقوق الإنسان.
Abstract
أوتوفاجي السائبة تتميز بعزل أجزاء كبيرة من السيتوبلازم إلى الهياكل المزدوجة-membrane متعددة تسمى أوتوفاجوسوميس. ويرد هنا بروتوكول بسيط لرصد هذه العملية. وعلاوة على ذلك، يتم توفير النتائج النموذجية والتجريبية التحقق من صحة الأسلوب تحت ظروف حمل أوتوفاجي في أنواع مختلفة من خلايا الثدييات المستزرعة. خلال أوتوفاجي السائبة، تنحية أوتوفاجوسوميس سيتوسول، وذلك أيضا للذوبان البروتينات سيتوسوليك، جنبا إلى جنب مع غيرها من البضائع أوتوفاجيك. رابطة حقوق الإنسان هي مستقرة وعالية الإنزيم سيتوسوليك وفيرة، والقابلة للذوبان هو المعزول غير انتقائية في أوتوفاجوسوميس. ولذلك يعكس مقدار تنحية رابطة حقوق الإنسان مبلغ السائبة تنحية أوتوفاجيك. لتحديد كفاءة ودقة تنحية رابطة حقوق الإنسان في الخلايا، نحن نوظف بروتوكولا تجزئة المستندة إلى اليكتروديسروبشن الذي يفصل فعالية سيديمينتابل من سيتوسوليك رابطة حقوق الإنسان، تليها قياس النشاط الأنزيمي في سيديمينتابل الكسور مقابل عينات كامل الخلية. عزل أوتوفاجيك يتحدد بطرح نسبة سيديمينتابل رابطة حقوق الإنسان في الخلايا غير المعالجة من تلك الخلايا في المعالجة. ميزة الفحص تنحية رابطة حقوق الإنسان أنه يعطي مقياس كمي لعزل أوتوفاجيك من البضائع المحلية، بدلاً من الأساليب الأخرى أما تنطوي على التعبير حمل خارج الرحم المسابير تنحية أو مبطلات شبه كمي حماية تحليلات لعلامات أوتوفاجي أو مستقبلات.
Introduction
أوتوفاجي (اليونانية “الأكل الذاتي”) عملية تطورية مصانة لتدهور رغوي/تعويض المواد داخل الخلايا. عند اكتشاف الجينات المرتبطة أوتوفاجي (“ATG”)، وهامة أوتوفاجي في الخميرة والبشر، والتحقيق أوتوفاجي أن يلعب دوراً هاما في صحة الإنسان والمرض (اعترف بفضل جائزة نوبل في الطب أو الفيزيولوجيا لعام 2016 يوشينوري اوشومي)، أوتوفاجي قد تصبح بسرعة واحدة من العمليات الأكثر كثافة درس في خلية علم الأحياء1،2.
ماكرووتوفاجي (يشار إليه فيما يلي “أوتوفاجي”) تتسم بالتوسع وقابلة للطي للغشاء داخل الخلايا سيستيرناي (“فاجوفوريس”) في هياكل مختومة، مزدوج أو متعدد membrane (“أوتوفاجوسوميس”) الذي عزل فعال المواد enwrapped من باقي السيتوبلازم. عند انصهار أوتوفاجوسوميس مع lysosomes، الغشاء أوتوفاجوسومال الداخلي والبضائع المنحاة المتدهورة والمعاد تدويرها. أوتوفاجوسوميس يمكن عزل المواد هيولى في عشوائية (غير انتقائية أوتوفاجي) وآداب الانتقائي (أوتوفاجي الانتقائي). أوتوفاجي الأكبر على الأرجح يمثل مزيجاً أوتوفاجي انتقائية وغير انتقائي.
في عام 1960 و 70 (“المورفولوجية عصر” البحوث أوتوفاجي)، وعزل أوتوفاجيك قيمت أساسا من خلال التحليلات ultrastructural. في ثمانينيات القرن الماضي وبداية تسعينيات القرن العشرين (” مرحلة البيوكيميائية ”) “كل سيجلين” وزملاء العمل – الذي درس أوتوفاجي في خلايا الكبد في الفئران الأولية – تطوير أساليب الأولى لقياس كمي تنحية أوتوفاجيك النشاط3. استخدام هذه الاختبارات، سيجلين تعريف ووصف مختلف الخطوات من4،أوتوفاجيك الليزوزومية المسار5، اكتشفت ويسك أمفيسومي6 (منتج الانصهار دخلول-أوتوفاجوسومي) وكان الأول من وصف دور الفسفرة البروتين في أوتوفاجي لائحة7. ومع ذلك، بعد اكتشاف أتجس في لعام 1990 (“عصر الجزيئية”)، ووصف أول بروتين ATG8 الثدييات، سلسلة البروتينات المرتبطة microtubule 1A/1B-الضوء 3 (LC3) في عام 20008، استخدام البروتينات ATG كعلامات عملية أوتوفاجيك سرعان ما اكتسب شعبية، وتركت الطرق البيوكيميائية الأكبر سنا وأكثر مشقة. وفي الواقع، على مدى 18 عاماً الماضية ولطخة غربية وتحاليل مجهرية fluorescence LC3 أصبحت حد بعيد الأكثر شعبية (وفي كثير من الحالات فقط) وسيلة لدراسة أوتوفاجي في خلايا الثدييات. الميزة هي السهولة النسبية التي يمكن تنفيذ هذه الأساليب. العيب أن واحداً دراسة مكون عربة (LC3) بدلاً من البضائع أوتوفاجيك الفعلية. وهذا عيب خطير بدلاً من ذلك، نظراً للعلاقة بين الدول و/أو التمويه LC3 من خلال المسار مقابل عزل وتدفق البضائع غير واضح جداً. وفي الواقع، أننا أظهرنا أنه يمكن الحفاظ على تدفق البضائع السائبة في مستويات عالية في ظروف حيث يوجد لا التمويه LC3، على الرغم من وجود LC3 مترافق في خلايا9. وعلاوة على ذلك، أثبتنا أن أوتوفاجي الأكبر لا تتأثر بكفاءة LC3 نضوب، وبالتالي يرجح أن هو مستقل LC39. وقد أكد هذا الاستنتاج في وقت لاحق LC3 الدراسات المغلوب10،11، التي تشير أيضا إلى أن تعتمد على باركين ميتوفاجي (أوتوفاجي انتقائية من الميتوكوندريا) بشكل مستقل LC310،11 .
وباختصار، هناك واضحة تحتاج لفحوصات على أساس الشحن لمراقبة نشاط أوتوفاجيك. على النحو الأمثل ينبغي أن تكون مثل هذه الاختبارات على نطاق واسع المنطبقة ومحددة تحديداً جيدا، وسهلة لتنفيذ. على مدى السنوات القليلة الماضية لقد أحطنا اهتماما خاصا بمقايسة تنحية رابطة حقوق الإنسان، التي وضعتها “كل سيجلين” في ثمانينيات القرن الماضي12، ويستند إلى قياس نقل رابطة حقوق الإنسان سيتوسوليك إلى سيديمينتابل، أوتوفاجيك الخلية التي تحتوي على المنقبضة الكسور. رابطة حقوق الإنسان هو بروتين سيتوسوليك مستقر وقابل للذوبان بسهولة المحتبس المشترك عند فاجوفوريس لف البضائع هيولى. ولذلك تنحية من رابطة حقوق الإنسان مقياس عام لعزل أوتوفاجيك. رابطة حقوق الإنسان المتدهورة حصرا ب المسار أوتوفاجيك الليزوزومية12. وبالتالي، وجود مثبطات تدهور الليزوزومية، مثلاً، بافيلوميسين A1 (Baf)13، آثار العلاج التجريبي مباشرة تعكس التغييرات في نشاط تنحية أوتوفاجيك. نظراً لغياب مثبطات التدهور، يمكن قياس الأثر الصافي للتعديلات في تنحية رابطة حقوق الإنسان والتدهور.
مقايسة تنحية رابطة حقوق الإنسان المطبقة على نطاق واسع، حيث يعبر رابطة حقوق الإنسان عاليا وأوبيكويتوسلي في جميع أنواع الخلايا، ويمكن قياس مستويات رابطة حقوق الإنسان بدقة تحليل الأنزيمي14،15. غير أن البروتوكول الأصلي12 – أنشئت في خلايا الكبد في الفئران الأولية – بدلاً من ذلك يستغرق وقتاً طويلاً ويتطلب كمية عالية من ابتداء من المواد، فضلا عن تفريغ كهربائي مصنوعة خصيصا مكثف. على نحو تدريجي، ونحن قد تحولت تدريجيا المقايسة إلى طريقة سهلة ومرنة. أولاً، البروتوكول الأصلي تم تكييفها للاستخدام في خلايا الثدييات الأسطر16. وثانيا، كان الأسلوب كثيرا المصغرة3،9. ثالثا، تم القضاء على العديد من الخطوات في البروتوكول، بما في ذلك كثافة شاقة وسادة الخطوة17. مكن هذا في نفس الوقت تصغير أبعد من الأسلوب، من نقطة البداية الأصلية لاستخدام لوحة 10 سم كل عينة16 إلى استخدام بئر واحدة من صفيحة 12-جيدا كل عينة (أيحوالي 15-fold أقل بدءاً 17من المواد). ورابعاً، حددنا جهاز انهانسر تجارية التي يمكن أن تحل محل مكثف تفريغ كهربائي مصنوعة خصيصا17.
ويرد هنا لدينا البروتوكول الأكثر حداثة للمقايسة تنحية رابطة حقوق الإنسان، التي تشمل بعض التبسيطات مواصلة أسلوب مقارنة ب نشرها مسبقاً17 . وعلاوة على ذلك، يتم إظهار مجموعة من النتائج النموذجية التي تم الحصول عليها في عدد من أنواع مختلفة من الخلايا، والأهم من ذلك، يتم توفير عدة أسطر من التصديقات التجريبية لأسلوب استخدام ضربة قاضية الدوائية فضلا عن الجينية والنهج خروج المغلوب. لمخطط تدفق الإجمالي البروتوكول كله، انظر الشكل 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
ويمثل البروتوكول الموصوفة هنا في ملخص، طريقة موثوقة وقابلة للتطبيق على نطاق واسع لمراقبة نشاط تنحية أوتوفاجيك الأكبر في خلايا الثدييات. مقارنة بالأسلوب الأصلي12،16، نحن إزالة عدد من الخطوات غير الضرورية، وتبسيط العديد من الخطوات المتبقية، وأدخلت تقليص حجم…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
كان هذا العمل دعم مالي من مجلس البحوث في النرويج وجامعة أوسلو، أندرس جهر مؤسسة، مؤسسة نانسن، والتركة في الذاكرة للأفغاني هنريك. ونشكر الدكتور نوبورو ميزُشيما ATG5 + + ميفس و ATG5–/–ميفس، الدكتور ماساكي كوماتسو ATG7 + + ميفس ATG7/ميفس، والدكتور شيزو أكيرا ATG9A + + ميفس و ATG9A/ميفس. ونشكر Sætre فرانك للمساعدة التقنية، والدكتور كل O. سيجلين للمناقشات البناءة بالمنهجية.
Materials
| 1.5 ml and 2 ml microcentrifuge tubes | Eppendorf | 211-2130 and 211-2120 | |
| 12-well plates | Falcon | 353043 | |
| Accumax cell detachment solution | Innovative Cell Technologies | A7089 | Keep aliquots at -20 °C for years, and in fridge for a few months |
| Bafilomycin A1 | Enzo | BML-CM110-0100 | Dissolve in DMSO |
| BJ cells | ATCC | CRL-2522 | use at passage <30 |
| Bovine serum albumin (BSA) | VWR | 422361V | |
| Burker counting chamber | Fisher Scientific | 139-658585 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | ThermoFisher Scientfic | C10228 | |
| Countess II Automated Cell Counter | ThermoFisher Scientfic | AMQAX1000 | |
| Cover glass for the Burker counting chamber | Fisher Scientific | 139-658586 | |
| Criterion Tris-HCl Gel, 4–20%, 26-well, 15 µl, 13.3 x 8.7 cm (W x L) | Bio-Rad | 3450034 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Earle's balanced salt solution (EBSS) | Gibco | 24010-043 | conatains 0.1% glucose |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E7889 | |
| Electroporation cuvette (4 mm) | Bio-Rad | 1652088 | |
| Exponential decay wave electroporator | BTX Harvard Apparatus | EMC 630 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma | F7524 | 10% final concentration in RPMI 1640 medium |
| HEK293 cells | ATCC | CRL-1573 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | 56750 | Autoclave a 65 mM solution and keep in fridge for months |
| Incubator; Autoflow IR Direct Heat CO2 incubator | NuAire | NU-5510E | |
| Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent | ThermoFisher | 13778150 | |
| LNCaP cells | ATCC | CRL-1740 | use at passage <30 |
| 3-Methyl Adenine (3MA) | Sigma-Aldrich | M9281 | Stock 100 mM in RPMI in -20 °C. Heat stock to 65 °C for 10 minutes, and use at 10 mM final concentration |
| Refridgerated Microcentrifuge | Beckman Coulter Life Sciences | 368831 | |
| Refridgerated Microcentrifuge with soft-mode function | Eppendorf | Eppendorf 5417R | |
| MRT67307 hydrochloride (ULKi) | Sigma-Aldrich | SML0702 | Inhibits ULK kinase activity. Dissolve in DMSO. |
| MaxMat Multianalyzer instrument | Erba Diagnostics | PL-II | |
| MCF7 cells | ATCC | HTB-22 | |
| NADH | Merck-Millipore | 1.24644.001 | |
| Nycodenz | Axis-Shield | 1002424 | |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium | ThermoFisher | 31985062 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 20012-019 | |
| Pipette tips 3 (0.5-20 µl) | VWR | 732-2223 | Thermo Fischer ART Barrier tips |
| Pipette tips (1-200 µl) | VWR | 732-2207 | Thermo Fischer ART Barrier tips |
| Pipette tips (100-1000µl) | VWR | 732-2355 | Thermo Fischer ART Barrier tips |
| Pipettes | ThermoFisher | 4701070 | Finnpipette F2 GLP Kit |
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P6407-10X5MG | Make a 1 mg/ml stock solution in sterile H2O. This solution is stable at -20 °C for at least 1 year. |
| Pyruvate | Merck-Millipore | 1066190050 | |
| RPE-1 cells (hTERT RPE-1) | ATCC | CRL-4000 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 21875-037 | |
| SAR-405 | ApexBio | A8883 | Inhibits phosphoinositide 3-kinase class III (PIK3C3). Dissolve in DMSO. |
| Silencer Select Negative Control #1 (siCtrl) | ThermoFisher/Ambion | 4390843 | |
| Silencer Select ATG9-targeting siRNA (siATG9A) | ThermoFisher/Ambion | s35504 | |
| Silencer Select FIP200-targeting siRNA (siFIP200) | ThermoFisher/Ambion | s18995 | |
| Silencer Select ULK1-targeting siRNA (siULK1) | ThermoFisher/Ambion | s15964 | |
| Silencer Select ULK2-targeting siRNA (siULK2) | ThermoFisher/Ambion | s18705 | |
| Silencer Select GABARAP-targeting siRNA (siGABARAP) | ThermoFisher/Ambion | s22362 | |
| Silencer Select GABARAPL1-targeting siRNA (siGABARAPL1) | ThermoFisher/Ambion | s24333 | |
| Silencer Select GABARAPL2-targeting siRNA (siGABARAPL2) | ThermoFisher/Ambion | s22387 | |
| Sodium phosphate monobasic dihydrate (NaH2PO4 • 2H2O) | Merck-Millipore | 1.06580.1000 | |
| Sodium phosphate dibasic dihydrate (Na2HPO4 • 2H2O ) | Prolabo | 28014.291 | |
| Sucrose | VWR | 443816T | 10% final concentration in water; filter through 0.45 µm filter and keep in fridge for months |
| Thapsigargin | Sigma-Aldrich | T9033 | Inhibits the SERCA ER Ca2+ pump. Dissolve in DMSO. |
| Triton X-405 | Sigma-Aldrich | X405 | 1% final |
| Trypan Blue stain 0.4% | Molecular Probes | T10282 | |
| Trypsin-EDTA (0.25% w/v Trypsin) | Gibco | 25200-056 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P2287 | 0.01% final |
Referenzen
- Rubinsztein, D. C., Frake, R. A. Yoshinori Ohsumi’s Nobel Prize for mechanisms of autophagy: from basic yeast biology to therapeutic potential. J R Coll Physicians Edinb. 46 (4), 228-233 (2016).
- Mizushima, N. The exponential growth of autophagy-related research: from the humble yeast to the Nobel Prize. FEBS Lett. 591 (5), 681-689 (2017).
- Seglen, P. O., et al. Macroautophagic cargo sequestration assays. Methods. 75, 25-36 (2015).
- Hoyvik, H., Gordon, P. B., Seglen, P. O. Use of a hydrolysable probe, [14C]lactose, to distinguish between pre-lysosomal and lysosomal steps in the autophagic pathway. Exp Cell Res. 166 (1), 1-14 (1986).
- Plomp, P. J., Gordon, P. B., Meijer, A. J., Hoyvik, H., Seglen, P. O. Energy dependence of different steps in the autophagic-lysosomal pathway. J Biol Chem. 264 (12), 6699-6704 (1989).
- Gordon, P. B., Seglen, P. O. Prelysosomal convergence of autophagic and endocytic pathways. Biochem Biophys Res Commun. 151 (1), 40-47 (1988).
- Holen, I., Gordon, P. B., Seglen, P. O. Protein kinase-dependent effects of okadaic acid on hepatocytic autophagy and cytoskeletal integrity. Biochem J. 284, 633-636 (1992).
- Kabeya, Y., et al. LC3, a mammalian homologue of yeast Apg8p, is localized in autophagosome membranes after processing. Embo j. 19 (21), 5720-5728 (2000).
- Szalai, P., et al. Autophagic bulk sequestration of cytosolic cargo is independent of LC3, but requires GABARAPs. Exp Cell Res. 333 (1), 21-38 (2015).
- Nguyen, T. N., et al. Atg8 family LC3/GABARAP proteins are crucial for autophagosome-lysosome fusion but not autophagosome formation during PINK1/Parkin mitophagy and starvation. J Cell Biol. , (2016).
- Pontano Vaites, L., Paulo, J. A., Huttlin, E. L., Harper, J. W. Systematic analysis of human cells lacking ATG8 proteins uncovers roles for GABARAPs and the CCZ1/MON1 regulator C18orf8/RMC1 in macro and selective autophagic flux. Mol Cell Biol. , (2017).
- Kopitz, J., Kisen, G. O., Gordon, P. B., Bohley, P., Seglen, P. O. Nonselective autophagy of cytosolic enzymes by isolated rat hepatocytes. J Cell Biol. 111 (3), 941-953 (1990).
- Bowman, E. J., Siebers, A., Altendorf, K. Bafilomycins: a class of inhibitors of membrane ATPases from microorganisms, animal cells, and plant cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 85 (21), 7972-7976 (1988).
- Hadjivassiliou, A. G., Rieder, S. V. The enzymatic assay of pyruvic and lactic acids. A definitive procedure. Clin Chim Acta. 19 (3), 357-361 (1968).
- Bergmeyer, H. U., Bernt, E., Bergmeyer, H. U. . Methods of enzymatic analysis (2nd English ed). 2, 574-579 (1974).
- Engedal, N., et al. Modulation of intracellular calcium homeostasis blocks autophagosome formation. Autophagy. 9 (10), 1475-1490 (2013).
- Luhr, M., et al. A Simple Cargo Sequestration Assay for Quantitative Measurement of Nonselective Autophagy in Cultured Cells. Methods Enzymol. 587, 351-364 (2017).
- Mousavi, S. A., et al. Effects of inhibitors of the vacuolar proton pump on hepatic heterophagy and autophagy. Biochim Biophys Acta. 1510 (1-2), 243-257 (2001).
- Seglen, P. O., Gordon, P. B. 3-Methyladenine: specific inhibitor of autophagic/lysosomal protein degradation in isolated rat hepatocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 79 (6), 1889-1892 (1982).
- Ronan, B., et al. A highly potent and selective Vps34 inhibitor alters vesicle trafficking and autophagy. Nat Chem Biol. 10 (12), 1013-1019 (2014).
- Saetre, F., Hagen, L. K., Engedal, N., Seglen, P. O. Novel steps in the autophagic-lysosomal pathway. Febs j. 282 (11), 2202-2214 (2015).
- Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (3rd edition). Autophagy. 12 (1), 1-222 (2016).
- Seglen, P. O., Overbye, A., Saetre, F. Sequestration assays for mammalian autophagy. Methods Enzymol. 452, 63-83 (2009).
- Hurley, J. H., Young, L. N. Mechanisms of Autophagy Initiation. Annu Rev Biochem. 86, 225-244 (2017).
- Thastrup, O., Cullen, P. J., Drobak, B. K., Hanley, M. R., Dawson, A. P. Thapsigargin, a tumor promoter, discharges intracellular Ca2+ stores by specific inhibition of the endoplasmic reticulum Ca2(+)-ATPase. Proc Natl Acad Sci U S A. 87 (7), 2466-2470 (1990).
- Kuma, A., et al. The role of autophagy during the early neonatal starvation period. Nature. 432 (7020), 1032-1036 (2004).
- Komatsu, M., et al. Impairment of starvation-induced and constitutive autophagy in Atg7-deficient mice. J Cell Biol. 169 (3), 425-434 (2005).
- Saitoh, T., et al. Atg9a controls dsDNA-driven dynamic translocation of STING and the innate immune response. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (49), 20842-20846 (2009).
- Gordon, P. B., Seglen, P. O. Autophagic sequestration of [14C]sucrose, introduced into rat hepatocytes by reversible electro-permeabilization. Exp Cell Res. 142 (1), 1-14 (1982).
- An, H., Harper, J. W. Systematic analysis of ribophagy in human cells reveals bystander flux during selective autophagy. Nat Cell Biol. 20 (2), 135-143 (2018).
- Fass, E., Shvets, E., Degani, I., Hirschberg, K., Elazar, Z. Microtubules support production of starvation-induced autophagosomes but not their targeting and fusion with lysosomes. J Biol Chem. 281 (47), 36303-36316 (2006).
- Velikkakath, A. K., Nishimura, T., Oita, E., Ishihara, N., Mizushima, N. Mammalian Atg2 proteins are essential for autophagosome formation and important for regulation of size and distribution of lipid droplets. Mol Biol Cell. 23 (5), 896-909 (2012).
- Øverbye, A., Sætre, F., Hagen, L. K., Johansen, H. T., Seglen, P. O. Autophagic activity measured in whole rat hepatocytes as the accumulation of a novel BHMT fragment (p10), generated in amphisomes by the asparaginyl proteinase, legumain. Autophagy. 7 (9), 1011-1027 (2011).
- Kominami, E., Hashida, S., Khairallah, E. A., Katunuma, N. Sequestration of cytoplasmic enzymes in an autophagic vacuole-lysosomal system induced by injection of leupeptin. J Biol Chem. 258 (10), 6093-6100 (1983).
- Rosado, C. J., Mijaljica, D., Hatzinisiriou, I., Prescott, M., Devenish, R. J. Rosella: a fluorescent pH-biosensor for reporting vacuolar turnover of cytosol and organelles in yeast. Autophagy. 4 (2), 205-213 (2008).
- Katayama, H., Kogure, T., Mizushima, N., Yoshimori, T., Miyawaki, A. A sensitive and quantitative technique for detecting autophagic events based on lysosomal delivery. Chem Biol. 18 (8), 1042-1052 (2011).
- Ogier-Denis, E., et al. A heterotrimeric Gi3-protein controls autophagic sequestration in the human colon cancer cell line HT-29. J Biol Chem. 270 (1), 13-16 (1995).
- Seglen, P. O., Gordon, P. B., Tolleshaug, H., Hoyvik, H. Use of [3H]raffinose as a specific probe of autophagic sequestration. Exp Cell Res. 162 (1), 273-277 (1986).
- Luhr, M., Sætre, F., Engedal, N. The Long-lived Protein Degradation Assay: an Efficient Method for Quantitative Determination of the Autophagic Flux of Endogenous Proteins in Adherent Cell Lines. Bio-protocol. 8 (9), e2836 (2018).
- Ronning, O. W., Pettersen, E. O., Seglen, P. O. Protein synthesis and protein degradation through the cell cycle of human NHIK 3025 cells in vitro. Exp Cell Res. 123 (1), 63-72 (1979).
- Seglen, P. O., Grinde, B., Solheim, A. E. Inhibition of the lysosomal pathway of protein degradation in isolated rat hepatocytes by ammonia, methylamine, chloroquine and leupeptin. Eur J Biochem. 95 (2), 215-225 (1979).
- Seglen, P. O., Solheim, A. E. Valine uptake and incorporation into protein in isolated rat hepatocytes. Nature of the precursor pool for protein synthesis. Eur J Biochem. 85 (1), 15-25 (1978).
- Bauvy, C., Meijer, A. J., Codogno, P. Assaying of autophagic protein degradation. Methods Enzymol. 452, 47-61 (2009).
- Engedal, N., Seglen, P. O. Autophagy of cytoplasmic bulk cargo does not require LC3. Autophagy. 12 (2), 1-3 (2016).
