Hier ist eine einfache und gut validierte Protokoll zur Messung der Masse selbstverdauende Sequestrierung Aktivität in Säugetierzellen beschrieben. Die Methode basiert auf der Quantifizierung des Anteils der Laktat-Dehydrogenase (LDH) im Sedimentable Zelle Fraktionen gegenüber dem gesamten zellulären LDH Niveau.
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Methodenartikel
Laktat-Dehydrogenase Sequestrierung Assay – Eine einfache und zuverlässige Methode zur Bestimmung Bulk Selbstverdauende Sequestration Aktivität in Säugerzellen
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Bulk Autophagie zeichnet sich durch die Sequestrierung große Teile der Zytoplasma in Doppel/multi-membrane Strukturen bezeichnet autophagosom. Hier ist ein einfaches Protokoll zur Überwachung dieses Prozesses beschrieben. Darüber hinaus sind typische Ergebnisse und experimentelle Validierung der Methode Autophagie-induzierenden Bedingungen in den verschiedenen Arten von kultivierten Säugerzellen vorgesehen. Während der Großteil Autophagie sequester autophagosom Zytosol, und damit auch lösliche cytosolischen Proteine, neben anderen selbstverdauende Ladung. LDH ist eine stabile und sehr reichlich, lösliche cytosolische Enzym, das nicht selektiv in autophagosom abgesondert wird. Die Höhe der LDH-Sequestrierung spiegelt daher die Menge an Masse selbstverdauende Sequestrierung. Um effizient und präzise LDH-Sequestrierung in Zellen bestimmen, setzen wir eine Electrodisruption-basierte Fraktionierung-Protokoll, die effektiv Sedimentable trennt sich von zytosolischen LDH, gefolgt durch eine Messung der Enzymaktivität in sedimentable Brüche im Vergleich zu ganzen Zellproben. Selbstverdauende-Sequestrierung wird durch Subtraktion des Anteils der Sedimentable LDH in den unbehandelten Zellen aus, dass im behandelten Zellen bestimmt. Der Vorteil des LDH-Sequestrierung Tests ist, dass es einem quantitativen Maß für die selbstverdauende Sequestrierung von endogenen Cargo, im Gegensatz zu anderen Methoden, dass entweder ektopische Expression von Sequestrierung Sonden oder semi-quantitativen Protease einbeziehen Schutz-Analysen der Autophagie Marker oder Rezeptoren.
Einleitung
Autophagie (griechisch für "Self-Essen") ist ein evolutionärer konservierten Prozess für vacuolar/lysosomalen Abbau der intrazellulären Material. Nach der Entdeckung der Autophagie-bezogene ("ATG") Gene, die für Autophagie in Hefe und Menschen wichtig sind, und die Erkenntnis, dass Autophagie spielt eine bedeutende Rolle in Gesundheit und Krankheit (anerkannt durch die 2016 den Nobelpreis für Medizin oder Physiologie Yoshinori Ohsumi), Autophagie ist eines der am intensivsten untersuchten Prozesse in der Zelle Biologie1,2schnell geworden.
Macroautophagy (nachfolgend "Autophagie") is....
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Protokoll
(1) Zelle Aussaat und Behandlung
-
Kultur adhärente Zellen in 75 cm2 Gewebe Kulturflaschen in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO2 bei 37 ° C, mit dem bevorzugten Kulturmedium für den Zelltyp in Frage. Können Sie die Zellen wachsen, bis sie eine in der Nähe von Zusammenfluss Zellschicht erreichen.
Hinweis: Verwenden Sie RPMI 1640 Medium ergänzt mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS) für LNCaP, HEK293, Maus embryonalen Fibroblasten (MEFs), BJ, MCF-7 und RPE-1-Zellen.- Waschen Sie die Zellen mit 3 mL 37 ° C Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS), pH-Wert 7,4. Ersetzen der PBS mit 3 mL 0,25 % (w/V) Trypsin-Ethy....
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Ergebnisse
Mit dem Protokoll beschrieben hier, Masse selbstverdauende Sequestrierung Aktivität in einer Reihe von verschiedenen Säugetieren Zelllinien, einschließlich LAPC4, DU145, Huh7, PNT2A, HeLa, VCaP, H3122, Hec1A, T47D, U2OS, PC3, MCF-7, G361, Maus embryonale Fibroblasten (MEFs), RPE-1, HEK293, BJ und LNCaP Zellen gemessen wurde. Sequestrierung war unter basalen Bedingungen (im kompletten, nährstoffreichen Medium) bewertet, oder in Zellen verhungert akut für Serum und Aminosäuren (eine Bon.......
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Diskussion
Zusammenfassend lässt sich sagen ist das Protokoll hier beschrieben eine zuverlässigere und vielseitig einsetzbar-Methode, um lose selbstverdauende Sequestrierung in Säugetierzellen zu überwachen. Im Vergleich zu der ursprünglichen Methode12,16, haben wir etliche unnötige Schritte entfernt, einige der verbleibenden Schritte vereinfacht und eingeführt, eine erhebliche Herabsetzung. Infolgedessen das Protokoll in Bezug auf Kosten und Zeit-Effizienz erheblich verbes.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben keinen Interessenkonflikt.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde von Research Council of Norway, der Universität von Oslo, Anders Jahre Foundation, der Nansen-Stiftung und das Erbe in der Erinnerung an Henrik Homan finanziell unterstützt. Wir danken Dr. Noboru Mizushima für die ATG5 + / + MEFs und ATG5/MEFs, Dr. Masaaki Komatsu für die ATG7 + / + MEFs und ATG7/MEFs und Dr. Shizuo Akira für die ATG9A + / + MEFs und ATG9A/MEFs. Wir danken Frank Sætre für technische Hilfe und Dr. pro O. Seglen für konstruktive methodische Diskussionen.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 1,5 mL und 2 mL Mikrozentrifugenröhrchen | Eppendorf | 211-2130 und 211-2120 | |
| 12-Well-Platten | Falcon | 353043 | |
| Accumax Lösung zur Zellablösung | Innovative Cell Technologies | A7089 | Halten Sie Aliquots bei -20 ° C für Jahre und im Kühlschrank für einige Monate |
| Bafilomycin A1 | Enzo | BML-CM110-0100 | Auflösen in DMSO |
| BJ Zellen | ATCC | CRL-2522 | Verwendung bei Passage < 30 |
| Rinderserumalbumin (BSA) | VWR | 422361V | |
| Burker Zählkammer | Fisher Scientific | 139-658585 | |
| Countess Zellzählkammer Objektträger | ThermoFisher Scientfic | C10228 | |
| Countess II Automatisierter Zellzähler | ThermoFisher Scientfic AMQAX1000 | ||
| Deckglas für die Burker Zählkammer | Fisher Scientific | 139-658586 | |
| Criterion Tris-HCl Gel, 4– 20 %, 26 Well, 15 & Mikro; L, 13.3 cm x 8.7 cm (B x L) | Bio-Rad | 3450034 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Earle's balanced salt solution (EBSS) | Gibco | 24010-043 | enthält 0,1 % Glukose |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E7889 | |
| Elektroporationsküvette (4 mm) | Bio-Rad | 1652088 | |
| Elektroporator mit exponentieller Zerfallswelle | BTX Harvard Apparate | EMC 630 | |
| Fötales Rinderserum (FBS) | Sigma | F7524 | 10% Endkonzentration in RPMI 1640 Medium |
| HEK293 Zellen | ATCC | CRL-1573 | |
| Imidazol | Sigma-Aldrich | 56750 | Autoklavieren Sie eine 65 mM Lösung und bewahren Sie sie monatelang im Kühlschrank |
| auf Inkubator; Autoflow IR Direct Heat CO2 Inkubator | NuAire | NU-5510E | |
| Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagenz | ThermoFisher | 13778150 | |
| LNCaP Zellen | ATCC | CRL-1740 | Verwendung bei der Passage < 30 |
| 3-Methyladenin (3MA) | Sigma-Aldrich | M9281 | Bestand 100 mM in RPMI bei -20 °C. Vorrat auf 65 &° erhitzen; C für 10 min und Verwendung bei einer Endkonzentration von 10 mM |
| Gekühlte Mikrozentrifuge | Beckman Coulter Life Sciences | 368831 | |
| Gekühlte Mikrozentrifuge mit Soft-Mode-Funktion | Eppendorf | Eppendorf 5417R | |
| MRT67307 Hydrochlorid (ULKi) | Sigma-Aldrich | SML0702 | Hemmt die ULK-Kinase-Aktivität. In DMSO auflösen. |
| MaxMat Multianalyzer Instrument | Erba Diagnostics | PL-II | |
| MCF7 Zellen | ATCC | HTB-22 | |
| NADH | Merck-Millipore | 1.24644.001 | |
| Nycodenz | Axis-Shield | 1002424 | |
| Opti-MEM Reduced Serum | Medium ThermoFisher | 31985062 | |
| Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) | Gibco | 20012-019 | |
| Pipettenspitzen 3 (0,5-20 µ L) | VWR | 732-2223 | Thermo Fischer ART Barrierespitzen |
| Pipettenspitzen (1-200 & micro; L) | VWR | 732-2207 | Thermo Fischer ART Barrier Tipps |
| Pipettenspitzen (100-1.000 &Mikro; L) | VWR | 732-2355 | Thermo Fischer ART Barrier Tipps |
| Pipetten | ThermoFisher | 4701070 | Finnpipette F2 GLP Kit |
| Poly-D-Lysin | Sigma-Aldrich | P6407-10X5MG | Stellen Sie eine 1 mg/ml-Stammlösung in sterilem H2O her. Diese Lösung ist stabil bei -20 ° C für mindestens 1 Jahr. |
| Pyruvat | Merck-Millipore | 1066190050 | |
| RPE-1 Zellen (hTERT RPE-1) | ATCC | CRL-4000 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 21875-037 | |
| SAR-405 | ApexBio | A8883 | Hemmt die Phosphoinositid-3-Kinase der Klasse III (PIK3C3). In DMSO auflösen. |
| Silencer Select Negative Control #1 (siCtrl) | ThermoFisher/Ambion | 4390843 | |
| Silencer Select ATG9-targeting-siRNA (siATG9A) | ThermoFisher/Ambion | s35504 | |
| Silencer Select FIP200-targeting-siRNA (siFIP200) | ThermoFisher/Ambion | s18995 | |
| Silencer Select ULK1-targeting-siRNA (siULK1) | ThermoFisher/Ambion | s15964 | |
| Silencer Select ULK2-targeting-siRNA (siULK2) | ThermoFisher/Ambion | s18705 | |
| Silencer Select GABARAP-targeting-siRNA (siGABARAP) | ThermoFisher/Ambion | s22362 | |
| Silencer Select GABARAPL1-targeting-siRNA (siGABARAPL1) | ThermoFisher/Ambion | s24333 | |
| Silencer Select GABARAPL2-targeting-siRNA (siGABARAPL2) | ThermoFisher/Ambion | s22387 | |
| Monobasisches Natriumphosphat-Dihydrat (NaH2PO4 & Bull; 2H2O) | Merck-Millipore | 1.06580.1000 | |
| Natriumphosphat zweibasisches Dihydrat (Na2HPO4 & Bull; 2H2O ) | Prolabo | 28014.291 | |
| Saccharose | VWR | 443816T | 10% Endkonzentration in Wasser; filtriert durch 0,45 & Mikro; m filtrieren und monatelang im Kühlschrank aufbewahren |
| Thapsigargin | Sigma-Aldrich | T9033 | Hemmt die SERCA ER Ca2+Pumpe. In DMSO auflösen. |
| Triton X-405 | Sigma-Aldrich | X405 | 1 % endgültig |
| Trypanblau-Färbung 0,4 % | Molekulare Sonden | T10282 | |
| Trypsin-EDTA (0,25 % w/v Trypsin) | Gibco | 25200-056 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P2287 | 0,01 % endgültig |
Referenzen
- Rubinsztein, D. C., Frake, R. A. Yoshinori Ohsumi's Nobel Prize for mechanisms of autophagy: from basic yeast biology to therapeutic potential. J R Coll Physicians Edinb. 46 (4), 228-233 (2016).
- Mizushima, N.
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Nachdrucke und Genehmigungen
