O ensaio de sequestro de lactato desidrogenase — Um método simples e confiável para determinar a atividade de Autophagic de sequestro em massa em células de mamíferos
Summary
Aqui, é descrito um protocolo simples e bem validado para medir a atividade de autophagic de sequestro em massa em células de mamíferos. O método baseia-se em quantificar a proporção de lactato desidrogenase (LDH) em frações de célula sedimentáveis em comparação com os níveis LDH totais do celulares.
Abstract
Autofagia em massa caracteriza-se por sequestro de grandes porções do citoplasma nas estruturas de duplo/multi-membrane denominado autophagosomes. Aqui um protocolo simples para monitorar este processo é descrito. Além disso, o típicos resultados e validação experimental do método sob condições indutoras autofagia em vários tipos de células de mamíferos cultivadas são fornecidos. Durante autofagia em massa, autophagosomes sequestrar citosol e desse modo também proteínas citosólica solúveis, juntamente com outras cargas autophagic. LDH é estável e altamente solúvel, abundante enzima citosólica que não seletivamente é sequestrada em autophagosomes. A quantidade de sequestro de LDH, portanto, reflete a quantidade de sequestro de autophagic em massa. Para eficiência e precisão determinar o sequestro de LDH em células, nós empregamos um protocolo baseado em electrodisruption de fracionamento que efetivamente separa sedimentáveis LDH citosólica, seguido de medida da atividade enzimática em sedimentáveis fracções contra amostras de células inteiras. Sequestro de autophagic é determinado subtraindo-se a proporção de sedimentáveis LDH em células não tratadas do que em células tratadas. A vantagem do ensaio do sequestro de LDH é que dá uma medida quantitativa da autophagic embargo da carga endógena, ao contrário de outros métodos que também envolvem expressão ectópica de sondas de sequestro ou semi-quantitativa de protease análises de proteção de marcadores de autofagia ou receptores.
Introduction
Autofagia (do grego para “Self comendo”) é um processo evolutivo e conservado pela degradação vacuolar/lysosomal do material intracelular. Após a descoberta de genes relacionados com autofagia (“ATG”), que são importantes para a autofagia no fermento e seres humanos, e a realização que autofagia desempenha um papel significativo na saúde e na doença (reconhecido por 2016 Prêmio Nobel de medicina ou fisiologia de Yoshinori Ohsumi), autofagia rapidamente se tornou um dos processos mais intensamente estudados na célula biologia1,2.
Macroautophagy (doravante referida como “autofagia”) é caracterizada pela expansão e dobramento de pequenos membrana intracelular (“phagophores”) em estruturas seladas, double ou multi membrane (“autophagosomes”) que efetivamente sequestram o enwrapped material do resto do citoplasma. Mediante a fusão de autophagosomes com lisossomos, membrana interna autophagosomal e a carga sequestrada é degradado e reciclados. Autophagosomes pode requisitar material citoplasmático em aleatória (não-seletivo autofagia) e modos seletiva (autofagia seletiva). Granel autofagia provavelmente representa uma mistura de autofagia não-seletivos e seletiva.
Nos anos 60 e 70 (“a morfológica era” da pesquisa de autofagia), sequestro de autophagic principalmente foi avaliado através de análises ultraestrutural. Na década de 1980 e início dos anos 90 (“a era bioquímico”) por Seglen e colegas de trabalho — quem estudou autofagia em hepatócitos primários de rato — desenvolveu os primeiro métodos para medir quantitativamente o sequestro autophagic atividade3. Usando estes ensaios, Seglen definidos e caracterizados diferentes etapas da via lisossomal-autophagic4,5, descoberto e cunhou o amphisome6 (o produto da fusão endossomo-autophagosome) e foi o primeiro a Descreva o papel da fosforilação de proteínas em autofagia Regulamento7. No entanto, após a descoberta dos ATGs de 1990 (“a era molecular”) e a primeira caracterização de uma proteína ATG8 mamíferos, proteína microtubule-associada 1A/1B-luz corrente 3 (LC3) em 20008, a utilização de proteínas ATG como marcadores para o autophagic processo rapidamente ganhou popularidade, e os mais velhos e mais trabalhosos métodos bioquímicos foram deixados para trás. Na verdade, durante os últimos 18 anos, borrão ocidental e análises de microscopia de fluorescência de LC3 tornaram-se de longe mais populares (e em muitos casos, o único) meio de estudar autofagia em células de mamíferos. A vantagem é a relativa facilidade pelo qual estes métodos podem ser realizados. A desvantagem é que um está estudando um componente de carrinho (LC3) ao invés de carga autophagic real. Esta é uma desvantagem bastante séria, porque a relação entre os Estados-Membros e/ou fluxo de LC3 através da via contra o sequestro e o fluxo de carga é altamente incerto. Na verdade, mostramos que o fluxo de carga em massa pode ser mantido em níveis elevados em condições onde não há nenhum fluxo LC3, apesar da presença de conjugados LC3 na9células. Além disso, temos demonstrado que autofagia em massa não é afetada pela depleção de LC3 eficiente e assim provavelmente é LC3-independente9. Este achado mais tarde foi confirmado por LC3 nocaute estudos10,11, que também indicam que mitophagy Parkin-dependente (a seletiva autofagia mitocondrial) é independente dos LC310,11 .
Em resumo, há uma clara necessidade ensaios baseados em carga monitorar a atividade do autophagic. Otimamente desses ensaios devem ser amplamente aplicável, bem definido e fácil de executar. Ao longo dos últimos anos, demos um interesse particular no ensaio de sequestro de LDH, que foi desenvolvido por Per Seglen na década de 198012e baseia-se na medição da transferência de LDH citosólico para sedimentáveis, célula vacúolo contendo autophagic frações. LDH é uma proteína citosólica estável, solúvel que prontamente co é sequestrada quando phagophores Wrap carga citoplasmática. Sequestro de LDH é, portanto, uma medida geral de sequestro autophagic. LDH é exclusivamente degradado pela via lisossomal-autophagic12. Assim, na presença de inibidores da degradação dos lisossomos, por exemplo, bafilomycin A1 (Baf)13, efeitos do tratamento experimental diretamente refletir alterações na atividade de sequestro autophagic. Na ausência de inibidores da degradação, o efeito líquido de alterações no sequestro de LDH e degradação pode ser medido.
O ensaio de sequestro de LDH é amplamente aplicável, desde que a LDH é altamente e ubiquitously expressa em todos os tipos de células, e os níveis LDH podem ser quantificados com precisão por um ensaio enzimático de14,15. No entanto, o original do protocolo12 — estabelecido em hepatócitos primários de rato — foi bastante demorado e exigiu uma alta quantidade de começar o material, bem como um capacitor feito por descarga elétrica. De uma forma faseada, nós transformaram gradualmente o ensaio em um método fácil e versátil. Em primeiro lugar, o protocolo original foi adaptado para uso em linhas de células de mamíferos16. Em segundo lugar, o método foi substancialmente downscaled3,9. Terceiro, várias etapas no protocolo foram eliminadas, incluindo uma almofada de densidade laborioso passo17. Isto permitiu simultaneamente uma regionalização ainda mais do método, do ponto de partida original do uso de uma placa de 10cm por exemplo16 usando um único poço de uma placa de 12 por amostra (ou seja, aproximadamente 15-fold menos começando material)17. Em quarto lugar, nós identificamos uma aparelho de eletroporação comercial que poderia substituir o capacitor de descarga elétrica sob medida17.
Aqui nosso protocolo mais atualizado do ensaio do sequestro de LDH, que inclui algumas simplificações adicionais do método em comparação com o anteriormente publicado17 é apresentado. Além disso, é mostrado um conjunto de resultados típicos obtidos em um número de diferentes tipos de células, e importante, várias linhas de validações experimentais do método usando o knockdown farmacológica, bem como genética e nocaute abordagens são fornecidas. Um regime global de fluxo do protocolo inteiro, veja a Figura 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
Em resumo, o protocolo descrito aqui representa um método confiável e amplamente aplicável para monitorar a atividade de autophagic de sequestro em massa em células de mamíferos. Em comparação com o original método de12,16, ter removido um número de etapas desnecessárias, simplificamos várias das etapas restantes e introduziu uma substancial redução de escala. Como resultado, o protocolo é muito melhorado em relação ao custo e tempo-eficiência, e…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado financeiramente pelo Conselho de pesquisa da Noruega, da Universidade de Oslo, o Anders Jahre Foundation, Fundação Nansen e o legado na memória do Henrik Homan. Agradecemos o Dr. Noboru Mizushima para o ATG5 + / + MEFs e ATG5-/-MEFs, Dr. Masaaki Komatsu para o ATG7 + / + MEFs e ATG7-/-MEFs e Dr. Shizuo Akira para o ATG9A + / + MEFs e ATG9A-/-MEFs. Agradecemos Frank Sætre para assistência técnica e Dr. Per O. Seglen discussões construtivas metodológicas.
Materials
| 1.5 ml and 2 ml microcentrifuge tubes | Eppendorf | 211-2130 and 211-2120 | |
| 12-well plates | Falcon | 353043 | |
| Accumax cell detachment solution | Innovative Cell Technologies | A7089 | Keep aliquots at -20 °C for years, and in fridge for a few months |
| Bafilomycin A1 | Enzo | BML-CM110-0100 | Dissolve in DMSO |
| BJ cells | ATCC | CRL-2522 | use at passage <30 |
| Bovine serum albumin (BSA) | VWR | 422361V | |
| Burker counting chamber | Fisher Scientific | 139-658585 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | ThermoFisher Scientfic | C10228 | |
| Countess II Automated Cell Counter | ThermoFisher Scientfic | AMQAX1000 | |
| Cover glass for the Burker counting chamber | Fisher Scientific | 139-658586 | |
| Criterion Tris-HCl Gel, 4–20%, 26-well, 15 µl, 13.3 x 8.7 cm (W x L) | Bio-Rad | 3450034 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Earle's balanced salt solution (EBSS) | Gibco | 24010-043 | conatains 0.1% glucose |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E7889 | |
| Electroporation cuvette (4 mm) | Bio-Rad | 1652088 | |
| Exponential decay wave electroporator | BTX Harvard Apparatus | EMC 630 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma | F7524 | 10% final concentration in RPMI 1640 medium |
| HEK293 cells | ATCC | CRL-1573 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | 56750 | Autoclave a 65 mM solution and keep in fridge for months |
| Incubator; Autoflow IR Direct Heat CO2 incubator | NuAire | NU-5510E | |
| Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent | ThermoFisher | 13778150 | |
| LNCaP cells | ATCC | CRL-1740 | use at passage <30 |
| 3-Methyl Adenine (3MA) | Sigma-Aldrich | M9281 | Stock 100 mM in RPMI in -20 °C. Heat stock to 65 °C for 10 minutes, and use at 10 mM final concentration |
| Refridgerated Microcentrifuge | Beckman Coulter Life Sciences | 368831 | |
| Refridgerated Microcentrifuge with soft-mode function | Eppendorf | Eppendorf 5417R | |
| MRT67307 hydrochloride (ULKi) | Sigma-Aldrich | SML0702 | Inhibits ULK kinase activity. Dissolve in DMSO. |
| MaxMat Multianalyzer instrument | Erba Diagnostics | PL-II | |
| MCF7 cells | ATCC | HTB-22 | |
| NADH | Merck-Millipore | 1.24644.001 | |
| Nycodenz | Axis-Shield | 1002424 | |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium | ThermoFisher | 31985062 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 20012-019 | |
| Pipette tips 3 (0.5-20 µl) | VWR | 732-2223 | Thermo Fischer ART Barrier tips |
| Pipette tips (1-200 µl) | VWR | 732-2207 | Thermo Fischer ART Barrier tips |
| Pipette tips (100-1000µl) | VWR | 732-2355 | Thermo Fischer ART Barrier tips |
| Pipettes | ThermoFisher | 4701070 | Finnpipette F2 GLP Kit |
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P6407-10X5MG | Make a 1 mg/ml stock solution in sterile H2O. This solution is stable at -20 °C for at least 1 year. |
| Pyruvate | Merck-Millipore | 1066190050 | |
| RPE-1 cells (hTERT RPE-1) | ATCC | CRL-4000 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 21875-037 | |
| SAR-405 | ApexBio | A8883 | Inhibits phosphoinositide 3-kinase class III (PIK3C3). Dissolve in DMSO. |
| Silencer Select Negative Control #1 (siCtrl) | ThermoFisher/Ambion | 4390843 | |
| Silencer Select ATG9-targeting siRNA (siATG9A) | ThermoFisher/Ambion | s35504 | |
| Silencer Select FIP200-targeting siRNA (siFIP200) | ThermoFisher/Ambion | s18995 | |
| Silencer Select ULK1-targeting siRNA (siULK1) | ThermoFisher/Ambion | s15964 | |
| Silencer Select ULK2-targeting siRNA (siULK2) | ThermoFisher/Ambion | s18705 | |
| Silencer Select GABARAP-targeting siRNA (siGABARAP) | ThermoFisher/Ambion | s22362 | |
| Silencer Select GABARAPL1-targeting siRNA (siGABARAPL1) | ThermoFisher/Ambion | s24333 | |
| Silencer Select GABARAPL2-targeting siRNA (siGABARAPL2) | ThermoFisher/Ambion | s22387 | |
| Sodium phosphate monobasic dihydrate (NaH2PO4 • 2H2O) | Merck-Millipore | 1.06580.1000 | |
| Sodium phosphate dibasic dihydrate (Na2HPO4 • 2H2O ) | Prolabo | 28014.291 | |
| Sucrose | VWR | 443816T | 10% final concentration in water; filter through 0.45 µm filter and keep in fridge for months |
| Thapsigargin | Sigma-Aldrich | T9033 | Inhibits the SERCA ER Ca2+ pump. Dissolve in DMSO. |
| Triton X-405 | Sigma-Aldrich | X405 | 1% final |
| Trypan Blue stain 0.4% | Molecular Probes | T10282 | |
| Trypsin-EDTA (0.25% w/v Trypsin) | Gibco | 25200-056 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P2287 | 0.01% final |
Referenzen
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