마우스 췌 장 내 분 비 세포의 단일 셀 Transcriptomic 분석
Summary
단일 셀 RNA 시퀀싱 뒤 미 발달, 신생아 및 산 후 췌 내 분 비 세포의 격리 하는 방법을 설명 합니다. 이 방법을 사용 하면 분석 췌 장 내 분 비 계보 개발의 셀이 transcriptomic 역학.
Abstract
독도에서 클러스터는 췌 장 내 분 비 세포는 혈액 포도 당 안정성과 에너지 대사 조절. 인슐린 분 비 하는 β 세포를 포함 하 여 독도에 뚜렷한 세포 유형 배아 단계에서 일반적인 내 분 비 창시자에서 구분 됩니다. 미 숙 내 분 비 세포는 세포 증식을 통해 확장 하 고 긴 출생 후 발달 기간 동안 성숙. 그러나, 이러한 프로세스를 기본 메커니즘 명확 하 게 정의 되지 않습니다. 단일 셀 RNA 시퀀싱은 뚜렷한 세포 인구와 추적 세포 계보 차별화 경로 특성에 대 한 유망한 접근 이다. 여기, 우리는 배아, 신생아 및 산 후 췌에서 고립 된 췌 장 β 세포의 단일 셀 RNA 시퀀싱에 대 한 메서드를 설명합니다.
Introduction
췌는 포유동물에 중요 한 변화 기관 이다. 췌 장 내 분 비와 외 분 비 구획 구성 됩니다. 췌 장 내 분 비 세포, 인슐린을 생산 하는 β 세포와 글 루카 곤 생성 α 세포를 포함 하 여 독도 Langerhans에 함께 클러스터링 하 고 전할 조직의 포도 당 항상성 조절. 내 분 비 세포의 기능 장애 결과 당뇨병 mellitus, 전세계 주요 공중 보건 문제가 되 고 있습니다.
췌 장 내 분 비 세포는 Ngn3에서 파생 된+ embryogenesis1동안 창시자. 나중에, perinatal 기간 동안 내 분 비 세포 증식 양식 미 성숙한 독도를. 이 미 성숙한 세포 개발 하 고 점차 성숙한 독도, 성인2혈액 포도 당 항상성 조절에 나가도록 풍부한 되는 계속.
비록 transcriptional 요인의 그룹 β 세포 분화를 조절 하는 발견 되었습니다, β 세포의 정확한 성숙 통로 아직 명확 하지 않습니다. 또한, β 세포 성숙 프로세스는 또한 셀 번호 확장3,4 의 규정 및 세포질이5,6세대 포함 한다. 그러나, 이러한 프로세스의 규제 메커니즘 하지 되었습니다 잘 공부 했습니다.
단일 셀 RNA 시퀀싱은 셀 부분 모집단을 프로 파일링 하 고 세포 계보 발달 경로7추적 수 있는 강력한 방법입니다. 이 기술, 단일 셀 레벨8에서 췌 장 섬 개발 중 발생 하는 이벤트를 해독 수 있습니다 키를 활용. 단일 셀 RNA 시퀀싱 프로토콜 중 스마트 seq2 향상 된 감도 정확도, 그리고 낮은 비용9표준 시 약의 사용 전장 cDNA의 생성을 허용 한다. 스마트 seq2 시퀀싱10cDNA 라이브러리를 만드는 데 약 2 일 소요 됩니다.
여기, 우리는 형광 활성화 된 세포 분류 (FACS)를 사용 하 여 성인 Ins1-RFP 유전자 변형 마우스11, 태아의 췌에서 형광 표시 된 β 세포의 격리 하는 방법을 제안 하 고 transcriptomic의 성능 분석에 스마트 seq2 기술 (그림 1)를 사용 하 여 단일 셀 수준입니다. 이 프로토콜은 일반, 병리학 및 노화 상태에서 각종 췌 장 내 분 비 세포의 transcriptomes 분석을 확장할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜에서 우리는 췌 장 β 세포의 단일 셀 식 프로필 공부에 대 한 효과적이 고 사용 하기 쉬운 방법 시연. 배아, 신생아 및 산 후 췌 내 분 비 세포를 분리 하 고 단일 셀 transcriptomic 분석을 수행 하려면이 메서드를 사용할 수 있습니다.
가장 중요 한 단계 좋은 조건에서 단일 β 세포의 고립입니다. 완전히 끼얹는다 췌 후속 소화에 더 나은 응답합니다. 일반적으로 등 쪽 ?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 생명 과학 컴퓨팅 플랫폼에 대 한 단백질 과학, 베이징 (북경 대학) 및 북경 칭화 센터에 대 한 국립 센터를 감사합니다. 이 작품의 과학 및 기술 (2015CB942800), 국립 자연 과학 재단의 중국 (31521004, 31471358, 및 31522036), 중국과의 북경 칭화 센터에서 C. R.X. 생명 과학에 대 한 자금에 의해 지원 되었다
Materials
| Collagenase P | Roche | 11213873001 | |
| Trypsin-EDTA (0.25 %), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200114 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30071.03 | |
| Dumont #4 Forceps | Roboz | RS-4904 | |
| Dumont #5 Forceps | Roboz | RS-5058 | |
| 30 G BD Needle 1/2" Length | BD | 305106 | |
| Stereo Microscope | Zeiss | Stemi DV4 | |
| Stereo Fluorescence microscope | Zeiss | Stereo Lumar V12 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap | BD-Falcon | 352235 | |
| 96-Well PCR Microplate | Axygen | PCR-96-C | |
| Silicone Sealing Mat | Axygen | AM-96-PCR-RD | |
| Thin Well PCR Tube | Extragene | P-02X8-CF | |
| Cell sorter | BD Biosciences | BD FACSAria | |
| Capillary pipette | Sutter | B100-58-10 | |
| RNaseZap | Ambion | AM9780 | |
| ERCC RNA Spike-In Mix | Life Technologies | 4456740 | |
| Distilled water | Gibco | 10977 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| dNTP mix | New England Biolabs | N0447 | |
| Recombinant RNase Inhibitor | Takara | 2313 | |
| Superscript II reverse transcriptase | Invitrogen | 18064-014 | |
| First-strand buffer (5x) | Invitrogen | 18064-014 | |
| DTT | Invitrogen | 18064-014 | |
| Betaine | Sigma-Aldrich | 107-43-7 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 7786-30-3 | |
| Nuclease-free water | Invitrogen | AM9932 | |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2x) | KAPA Biosystems | KK2601 | |
| VAHTS DNA Clean Beads XP beads | Vazyme | N411-03 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32854 | |
| AceQ qPCR SYBR Green Master Mix | Vazyme | Q121-02 | |
| TruePrep DNA Library Prep Kit V2 for Illumina | Vazyme | TD502 | Include 5x TTBL, 5x TTE, 5x TS, 5x TAB, TAE |
| TruePrep Index Kit V3 for Illumina | Vazyme | TD203 | Include 16 N6XX and 24 N8XX |
| High Sensitivity NGS Fragment Analysis Kit | Advanced Analytical Technologies | DNF-474 | |
| 1x HBSS without Ca2+ and Mg2+ | 138 mM NaCl; 5.34 mM KCl 4.17 mM NaHCO3; 0.34 mM Na2HPO4 0.44 mM KH2PO4 |
||
| Isolation buffer | 1 × HBSS containing 10 mM HEPES, 1 mM MgCl2, 5 mM Glucose, pH 7.4 | ||
| FACS buffer | 1 × HBSS containing 15 mM HEPES, 5.6 mM Glucose, 1% FBS, pH 7.4 | ||
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S6297 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S5136 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| Oligo-dT30VN primer | 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACT30VN-3' | ||
| TSO | 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACATrGrG+G-3' | ||
| ISPCR primers | 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3' | ||
| Gapdh Forward primer | 5'-ATGGTGAAGGTCGGTGTGAAC-3' | ||
| Gapdh Reverse primer | 5'-GCCTTGACTGTGCCGTTGAAT-3' | ||
| Ins2 Forward primer | 5'-TGGCTTCTTCTACACACCCA-3' | ||
| Ins2 Reverse primer | 5'-TCTAGTTGCAGTAGTTCTCCA-3' |
Referenzen
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