Анализ одной ячейки транскриптомики эндокринных клеток поджелудочной железы мыши
Summary
Мы описываем метод для изоляции эндокринных клеток эмбриона, неонатальной и послеродовой поджелудочная железа, последовал сингл клеточной РНК последовательности. Этот метод позволяет анализ поджелудочной железы эндокринной линии развития, ячейка неоднородность и транскриптомики динамику.
Abstract
Эндокринных клеток поджелудочной железы, которые сгруппированы в островки, регулируют стабильности глюкозы крови и энергии метаболизма. Типы отдельных клеток в островки, включая секреции инсулина β-клетками, отличаются от общей эндокринных прародителями на эмбриональной стадии. Незрелые эндокринные клетки расширить через пролиферации клеток и зрелые период долго постнатального развития. Однако механизмы, лежащие в основе этих процессов четко не определены. Одноместный клеточной РНК последовательности является перспективным подходом для характеризации различных клеточных популяций и трассировки клеток линии дифференциация путей. Здесь мы описываем метод для одноклеточных РНК секвенирование изолированных поджелудочной железы β клеток эмбриона, неонатальной и послеродовой поджелудочная железа.
Introduction
Поджелудочная железа является жизненно важным органом метаболизма у млекопитающих. Поджелудочной железы состоит из эндокринной и экзокринной отсеков. Эндокринных клеток поджелудочной железы, включая инсулин продуцирующих клеток β и глюкагон продуцирующие клетки α, кластер вместе в островки Лангерганса и соответственно регулировать системных глюкозы гомеостаза. Дисфункцию эндокринных клеток приводит к сахарный диабет, который стал проблемой общественного здравоохранения во всем мире.
Эндокринных клеток поджелудочной железы являются производными от Ngn3+ прародителями во время эмбриогенеза1. Позже в перинатальный период, эндокринные клетки размножаются незрелых островков формы. Эти незрелые клетки продолжают развиваться и постепенно стать зрелой островков, которые становятся Богато васкуляризированной регулировать гомеостаз глюкозы крови в2взрослых.
Хотя были определены группы транскрипционный анализ факторов, которые регулируют β дифференцировки клеток, точные созревания путь β-клеток до сих пор неясно. Кроме того процесс созревания клеток β также включает в себя регулирование ячейки номер расширения3,4 и поколение сотовой неоднородность5,6. Однако механизмы регулирования этих процессов не были хорошо изучены.
Одноместный клеточной РНК последовательность является мощный подход, который может профиль субпопуляции клеток и отслеживать клеток линии развития пути7. Воспользовавшись этой технологии, ключ, который может быть расшифрована события, которые происходят во время разработки поджелудочной островок на одной ячейки уровня8. Среди одноклеточных РНК последовательность протоколов смарт seq2 позволяет поколение полнометражного cDNA с улучшена чувствительность и точность и использование стандартных реагентов на более низких затрат9. Смарт seq2 занимает около двух дней, чтобы построить кДНК библиотеки для секвенирования10.
Здесь, мы предлагаем метод для изоляции флуоресцировани обозначенного β клеток от поджелудочная железа из плода для взрослых Ins1-ЗП трансгенных мышей11, используя активированный флуоресценции клеток, сортируя (FACS) и производительность транскриптомики анализ на уровень одной ячейки, используя технологию смарт seq2 (рис. 1). Этот протокол может быть продлен для анализа transcriptomes всех типов эндокринных клеток поджелудочной железы в государствах нормальной, патологических и старения.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этом протоколе мы продемонстрировали эффективный и простой в использовании метод для изучения одной ячейки выражение профили клеток поджелудочной железы β. Этот метод может использоваться для выполнения одной ячейки транскриптомики анализов и изолировать эндокринных клеток эмбри…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Национальный центр наук белка, Пекин (Пекинский университет) и Peking-Цинхуа центр вычислительной платформы науки о жизни. Эта работа была поддержана Министерством науки и техники Китая (2015CB942800), Национальный фонд Китая естественных наук (31521004, 31471358 и 31522036), и финансирование от Peking-Цинхуа Центр наук о жизни в C.-R.X.
Materials
| Collagenase P | Roche | 11213873001 | |
| Trypsin-EDTA (0.25 %), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200114 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30071.03 | |
| Dumont #4 Forceps | Roboz | RS-4904 | |
| Dumont #5 Forceps | Roboz | RS-5058 | |
| 30 G BD Needle 1/2" Length | BD | 305106 | |
| Stereo Microscope | Zeiss | Stemi DV4 | |
| Stereo Fluorescence microscope | Zeiss | Stereo Lumar V12 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap | BD-Falcon | 352235 | |
| 96-Well PCR Microplate | Axygen | PCR-96-C | |
| Silicone Sealing Mat | Axygen | AM-96-PCR-RD | |
| Thin Well PCR Tube | Extragene | P-02X8-CF | |
| Cell sorter | BD Biosciences | BD FACSAria | |
| Capillary pipette | Sutter | B100-58-10 | |
| RNaseZap | Ambion | AM9780 | |
| ERCC RNA Spike-In Mix | Life Technologies | 4456740 | |
| Distilled water | Gibco | 10977 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| dNTP mix | New England Biolabs | N0447 | |
| Recombinant RNase Inhibitor | Takara | 2313 | |
| Superscript II reverse transcriptase | Invitrogen | 18064-014 | |
| First-strand buffer (5x) | Invitrogen | 18064-014 | |
| DTT | Invitrogen | 18064-014 | |
| Betaine | Sigma-Aldrich | 107-43-7 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 7786-30-3 | |
| Nuclease-free water | Invitrogen | AM9932 | |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2x) | KAPA Biosystems | KK2601 | |
| VAHTS DNA Clean Beads XP beads | Vazyme | N411-03 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32854 | |
| AceQ qPCR SYBR Green Master Mix | Vazyme | Q121-02 | |
| TruePrep DNA Library Prep Kit V2 for Illumina | Vazyme | TD502 | Include 5x TTBL, 5x TTE, 5x TS, 5x TAB, TAE |
| TruePrep Index Kit V3 for Illumina | Vazyme | TD203 | Include 16 N6XX and 24 N8XX |
| High Sensitivity NGS Fragment Analysis Kit | Advanced Analytical Technologies | DNF-474 | |
| 1x HBSS without Ca2+ and Mg2+ | 138 mM NaCl; 5.34 mM KCl 4.17 mM NaHCO3; 0.34 mM Na2HPO4 0.44 mM KH2PO4 |
||
| Isolation buffer | 1 × HBSS containing 10 mM HEPES, 1 mM MgCl2, 5 mM Glucose, pH 7.4 | ||
| FACS buffer | 1 × HBSS containing 15 mM HEPES, 5.6 mM Glucose, 1% FBS, pH 7.4 | ||
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S6297 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S5136 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| Oligo-dT30VN primer | 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACT30VN-3' | ||
| TSO | 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACATrGrG+G-3' | ||
| ISPCR primers | 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3' | ||
| Gapdh Forward primer | 5'-ATGGTGAAGGTCGGTGTGAAC-3' | ||
| Gapdh Reverse primer | 5'-GCCTTGACTGTGCCGTTGAAT-3' | ||
| Ins2 Forward primer | 5'-TGGCTTCTTCTACACACCCA-3' | ||
| Ins2 Reverse primer | 5'-TCTAGTTGCAGTAGTTCTCCA-3' |
Referenzen
- Gu, G., Dubauskaite, J., Melton, D. A. Direct evidence for the pancreatic lineage: NGN3+ cells are islet progenitors and are distinct from duct progenitors. Development. 129 (10), 2447-2457 (2002).
- Oliver-Krasinski, J. M., Stoffers, D. A. On the origin of the beta cell. Genes & Development. 22 (15), 1998-2021 (1998).
- Dor, Y., Brown, J., Martinez, O. I., Melton, D. A. Adult pancreatic beta-cells are formed by self-duplication rather than stem-cell differentiation. Nature. 429 (6987), 41-46 (2004).
- Smukler, S. R., et al. The adult mouse and human pancreas contain rare multipotent stem cells that express insulin. Cell Stem Cell. 8 (3), 281-293 (2011).
- Dorrell, C., et al. Human islets contain four distinct subtypes of beta cells. Nature Communications. 7, 11756 (2016).
- Bader, E., et al. Identification of proliferative and mature beta-cells in the islets of Langerhans. Nature. 535 (7612), 430-434 (2016).
- Saliba, A. E., Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. Single-cell RNA-seq: Advances and future challenges. Nucleic Acids Research. 42 (14), 8845-8860 (2014).
- Qiu, W. L., et al. Deciphering pancreatic islet beta cell and alpha cell maturation pathways and characteristic features at the single-cell level. Cell Metabolism. 25 (5), 1194-1205 (2017).
- Picelli, S., et al. Smart-seq2 for sensitive full-length transcriptome profiling in single cells. Nature Methods. 10 (11), 1096-1098 (2013).
- Picelli, S., et al. Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2. Nature Protocols. 9 (1), 171-181 (2014).
- Piccand, J., et al. Pak3 promotes cell cycle exit and differentiation of beta-cells in the embryonic pancreas and is necessary to maintain glucose homeostasis in adult mice. Diabetes. 63 (1), 203-215 (2014).
- Veite-Schmahl, M. J., Regan, D. P., Rivers, A. C., Nowatzke, J. F., Kennedy, M. A. Dissection of the mouse pancreas for histological analysis and metabolic profiling. Journal of Visualized Experiments. (126), (2017).
- Hu, P., Zhang, W., Xin, H., Deng, G. Single cell isolation and analysis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 116 (2016).
- Haque, A., Engel, J., Teichmann, S. A., Lonnberg, T. A practical guide to single-cell RNA-sequencing for biomedical research and clinical applications. Genome Medicine. 9 (1), 75 (2017).
- . FastQC: A quality control tool for high throughput sequence data Available from: https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2010)
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
- Kim, D., et al. TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions. Genome Biology. 14 (4), (2013).
- Anders, S., Pyl, P. T., Huber, W. HTSeq–a Python framework to work with high-throughput sequencing data. Bioinformatics. 31 (2), 166-169 (2015).
- Wagner, G. P., Kin, K., Lynch, V. J. Measurement of mRNA abundance using RNA-seq data: RPKM measure is inconsistent among samples. Theory in Biosciences. 131 (4), 281-285 (2012).
- Brennecke, P., et al. Accounting for technical noise in single-cell RNA-seq experiments. Nature Methods. 10 (11), 1093-1095 (2013).
- Le, S., Josse, J., Husson, F. FactoMineR: An R package for multivariate analysis. Journal of Statistical Software. 25 (1), (2008).
- Hadley, W. . ggplot2: Elegant graphics for data analysis. , (2009).
- . gplots: Various R Programming Tools for Plotting Data Available from: https://cran.r-project.org/package=gplots (2016)
- Marcheva, B., et al. Disruption of the clock components CLOCK and BMAL1 leads to hypoinsulinaemia and diabetes. Nature. 466 (7306), 627-631 (2010).
- Li, L., et al. Single-cell RNA-seq analysis maps development of human germline cells and gonadal niche interactions. Cell Stem Cell. , (2017).
- Qi, M., et al. Human pancreatic islet isolation: Part I: Digestion and collection of pancreatic tissue. Journal of Visualized Experiments. (27), (2009).
- Qi, M., et al. Human pancreatic islet isolation: Part II: Purification and culture of human islets. Journal of Visualized Experiments. (27), (2009).
- Teo, A. K. K., et al. Single-cell analyses of human islet cells reveal de-differentiation signatures. Cell Death Discovery. 4 (14), (2018).
