DÉCELLULARISATION du cœur humain à l’intérieur d’une poche sous pression dans une Orientation inversée
Summary
Cette méthode permet de DÉCELLULARISATION d’un organe solide complexe à l’aide d’un protocole simple basé sur un choc osmotique et la perfusion de détergent ionique avec une interruption minimale orgue matrice. Elle compose d’une technique de DÉCELLULARISATION roman pour les coeurs humains à l’intérieur d’une poche sous pression avec un suivi en temps réel du débit de flux dynamique et cellulaires de débris.
Abstract
La solution ultime pour les patients atteints d’insuffisance cardiaque terminale est une transplantation d’organe. Mais coeurs donneurs sont limitées, immunosuppression est nécessaire, et finalement le rejet peut se produire. Création d’une fonctionnelle, autologue coeur bio-artificiel pourrait résoudre ces défis. Biofabrication d’un cœur composé de cellules et l’échafaudage est une option. Un échafaudage naturel avec la composition spécifique des tissus, mais aussi les micro – et macro-architecture peut être obtenu par les coeurs decellularizing les humains ou les grands animaux comme le porc. DÉCELLULARISATION consiste à laver les débris cellulaires, tout en préservant les système vasculaire et la matrice extracellulaire 3D et permettant de « cellularisation » à un plus tard validant. Capitalisant sur notre roman trouver cette DÉCELLULARISATION de perfusion des organes complexes est possible, nous avons développé une méthode plus « physiologique » pour decellularize les coeurs humains non transplantables en les plaçant à l’intérieur d’une poche sous pression, dans une inversion orientation, sous pression contrôlée. À l’aide d’une poche sous pression vise à créer des gradients de pression à travers la valve aortique à garder fermée et améliorer la perfusion myocardique. Évaluation simultanée de la dynamique de l’écoulement et l’élimination de débris cellulaires lors DÉCELLULARISATION nous a permis de surveiller les transmissions apports et les retraits de débris, générant ainsi un échafaudage qui peut être utilisé soit pour une simple réparation cardiaque (par exemple comme un patch ou échafaudage de soupape) ou comme un échafaudage tout grand orgue.
Introduction
Insuffisance cardiaque entraîne une mortalité élevée chez les patients. L’option de traitement ultime pour l’insuffisance cardiaque terminale est allo-greffe. Cependant, il y a une longue liste d’attente pour une transplantation en raison de la pénurie d’organes de donneurs et les patients visage après la transplantation les obstacles qui vont de l’immunosuppression à orgue chronique rejet1,2. Cœurs fonctionnels bioingénierie de repeuplement DECELLULARISE coeurs à taille humaine avec un personnel du patient les cellules pourraient contourner ces obstacles3.
Une étape importante dans « engineering », un coeur est la création d’un échafaudage avec une structure vasculaire et parenchymateuse appropriée, composition et fonction pour guider l’alignement et l’Organisation des cellules livrées. En présence d’un cadre approprié, les cellules ensemencées sur l’échafaud devraient reconnaître l’environnement et remplir la fonction attendue dans le cadre de cet organe. À notre avis, matrice extracellulaire DECELLULARISE orgue (dECM) comprend les caractéristiques nécessaires de l’échafaudage idéal.
En utilisant la vascularisation intrinsèque, complexe DÉCELLULARISATION ensemble-organe peut être atteint via antérograde ou rétrograde perfusion4 pour supprimer les composants cellulaires tout en préservant la matrice extracellulaire 3D délicate et système vasculaire2, 5,6,7. Une vascularisation fonctionnelle est importante dans les organes entiers de bioingénierie justes comme in vivo, pour la distribution des éléments nutritifs et d’enlèvement des déchets8. DÉCELLULARISATION perfusion coronaire s’est avérée pour être efficace dans la création de DECELLULARISE coeurs de rats4ou cochons4,7,9,10,11 ,12,13et les humains5,7,14,15,16. Pourtant, l’intégrité des valves, oreillettes et autres régions « minces » peut souffrir.
Taille humaine DECELLULARISE coeur échafaudages peuvent être obtenus auprès de porcs à l’aide de pression contrôle7,9,10,11,12 ou infusion débit taux contrôle13, 17 et de donneurs humains en utilisant la pression de contrôle5,7,14,15. DÉCELLULARISATION de coeurs donneurs humains se produit plus de 4 à 8 jours sous pression contrôlée à 80-100 mmHg à orientation verticale5,15,16 ou plus de 16 jours sous pression contrôlée à 60 mmHg14 . Sous antérograde, DÉCELLULARISATION sous pression contrôlée, la compétence de la valve aortique joue un rôle crucial dans le maintien de l’efficacité de la perfusion coronaire et pression stable à la racine aortique. Nos travaux antérieurs ont révélé que l’orientation du cœur influe sur son efficacité de perfusion coronarienne au cours de la procédure de DÉCELLULARISATION et, par conséquent, l’intégrité de l’échafaudage à la fin9.
Dans le prolongement de notre précédent travail9, nous introduisons un nouveau concept dans lequel une pochette comme péricarde est ajoutée afin d’améliorer ensemble-coeur DÉCELLULARISATION. Nous décrivons la DÉCELLULARISATION de coeurs humains placés à l’intérieur de pochettes sous pression, orientés inversement et sous pression contrôlée à 120 mmHg à la racine aortique. Ce protocole comprend la surveillance de la collection des médias de flux sortant tout au long de la procédure de DÉCELLULARISATION afin d’évaluer l’efficacité de la perfusion coronaire et l’enlèvement des débris cellulaires et le profil d’écoulement. Des épreuves biochimiques sont ensuite effectuées pour vérifier l’efficacité de la méthode.
Protocol
Representative Results
Discussion
À notre connaissance, c’est la première étude à DÉCELLULARISATION rapport inversé de cœurs humains à l’intérieur d’une poche sous pression avec Time-lapse suivi de l’enlèvement des débris débit taux et cellules. La pochette du péricarde-comme conserve l’orientation du cœur stable tout au long de la procédure de DÉCELLULARISATION. Immerger et inversant les cœurs entiers à l’intérieur d’une poche empêche la déshydratation et minimise les contraintes excessives sur l’aorte (à partir du …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette recherche a été financée par l’octroi de fonds de dotation de Houston et le Texas Emerging Technology Fund. Les auteurs remercient l’Agence d’approvisionnement orgue LifeGift, Inc. et la famille du donateur pour la réalisation de cette étude.
Materials
| 2-0 silk suture | Ethicon | SA85H | Suture used to ligate superior and inferior vena cava |
| 1/4" x 3/8" connector with luer | NovoSci | 332023-000 | Connect aorta and pulmonary artery |
| Masterflex platinum-cured silicone tubing | Cole-Parmer | HV-96410-16 | Tubing to connect heart chambers/veins |
| infusion and outflow line | Smiths Medical | MX452FL | For flowing solutions through the vasculature |
| Polyester pouch (Ampak 400 Series SealPAK Pouches) | Fisher scientific | 01-812-17 | Pericardium-like pouch for containing heart during decellularization |
| Snapware Square-Grip Canister | Snapware | 1022 | 1-liter Container used for perfusing heart |
| Black rubber stoppers | VWR | 59586-162 | To seal the perfusion container |
| Peristaltic pump | Harvard Apparatus | 881003 | To pump fluid through the inflow lines and to drain fluids |
| 2 L aspirator bottle with bottom sidearm | VWR | 89001-532 | For holding solutions/perfusate |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay kit | Life Technologies | P7589 | For quantifying dsDNA |
| Calf thymus standard | Sigma | D4522 | DNA standard |
| Blyscan Glycosaminoglycan Assay Kit | Biocolor Ltd | Blyscan #B1000 | GAG assay kit |
| Plate reader | Tecan | Infinite M200 Pro | For analytical assays |
| GE fluoroscopy | General Electric | OEC 9900 Elite | Angiogram |
| Visipaque | GE | 13233575 | Contrast agent |
Referenzen
- Writing Group Members. Executive Summary: Heart Disease and Stroke Statistics–2016 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 133 (4), 447-454 (2016).
- Zia, S., et al. Hearts beating through decellularized scaffolds: whole-organ engineering for cardiac regeneration and transplantation. Critical Reviews in Biotechnology. 36 (4), 705-715 (2016).
- Zimmermann, W. H. Strip and Dress the Human Heart. Circulation Research. 118 (1), 12-13 (2016).
- Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: Using nature’s platform to engineer a bioartificial heart. Nature Medicine. 14 (2), 213-221 (2008).
- Sanchez, P. L., et al. Acellular human heart matrix: A critical step toward whole heart grafts. Biomaterials. 61, 279-289 (2015).
- Peloso, A., et al. Current achievements and future perspectives in whole-organ bioengineering. Stem Cell Research & Therapy. 6, 107 (2015).
- Guyette, J. P., et al. Perfusion decellularization of whole organs. Nature Protocols. 9 (6), 1451-1468 (2014).
- Momtahan, N., Sukavaneshvar, S., Roeder, B. L., Cook, A. D. Strategies and Processes to Decellularize and Cellularize Hearts to Generate Functional Organs and Reduce the Risk of Thrombosis. Tissue Engineering Part B-Reviews. 21 (1), 115-132 (2015).
- Lee, P. F., et al. Inverted orientation improves decellularization of whole porcine hearts. Acta Biomaterialia. , (2016).
- Momtahan, N., et al. Automation of Pressure Control Improves Whole Porcine Heart Decellularization. Tissue Eng Part C Methods. , (2015).
- Weymann, A., et al. Development and Evaluation of a Perfusion Decellularization Porcine Heart Model – Generation of 3-Dimensional Myocardial Neoscaffolds. Circulation Journal. 75 (4), 852-860 (2011).
- Weymann, A., et al. Bioartificial heart: A human-sized porcine model–the way ahead. PLoS One. 9 (11), e111591 (2014).
- Remlinger, N. T., Wearden, P. D., Gilbert, T. W. Procedure for decellularization of porcine heart by retrograde coronary perfusion. Journal of Visualized Experiments. (70), e50059 (2012).
- Guyette, J. P., et al. Bioengineering Human Myocardium on Native Extracellular Matrix. Circulation Research. 118 (1), 56-72 (2016).
- Sanchez, P. L., et al. Data from acellular human heart matrix. Data Brief. 8, 211-219 (2016).
- Garreta, E., et al. Myocardial commitment from human pluripotent stem cells: Rapid production of human heart grafts. Biomaterials. 98, 64-78 (2016).
- Wainwright, J. M., et al. Preparation of Cardiac Extracellular Matrix from an Intact Porcine Heart. Tissue Engineering Part C-Methods. 16 (3), 525-532 (2010).
- Larson, A. M., Yeh, A. T. Ex vivo characterization of sub-10-fs pulses. Optics Letters. 31 (11), 1681-1683 (2006).
- Lee, P. F., Yeh, A. T., Bayless, K. J. Nonlinear optical microscopy reveals invading endothelial cells anisotropically alter three-dimensional collagen matrices. Experimental Cell Research. 315 (3), 396-410 (2009).
- Lee, P. F., Bai, Y., Smith, R. L., Bayless, K. J., Yeh, A. T. Angiogenic responses are enhanced in mechanically and microscopically characterized, microbial transglutaminase crosslinked collagen matrices with increased stiffness. Acta Biomaterialia. 9 (7), 7178-7190 (2013).
- Wu, Z., et al. Multi-photon microscopy in cardiovascular research. Methods. 130, 79-89 (2017).
- Ramanathan, T., Skinner, H. Coronary blood flow. Continuing Education in Anaesthesia Critical Care & Pain. 5 (2), 61-64 (2005).
- Murthy, V. L., et al. Clinical Quantification of Myocardial Blood Flow Using PET: Joint Position Paper of the SNMMI Cardiovascular Council and the ASNC. Journal of Nuclear Cardiology. 25 (1), 269-297 (2018).
- Molina, D. K., DiMaio, V. J. Normal organ weights in men: Part I-the heart. The American Journal of Forensic Medicine and Pathology. 33 (4), 362-367 (2012).
- Molina, D. K., DiMaio, V. J. Normal Organ Weights in Women: Part I-The Heart. The American Journal of Forensic Medicine and Pathology. 36 (3), 176-181 (2015).
- Robertson, M. J., Dries-Devlin, J. L., Kren, S. M., Burchfield, J. S., Taylor, D. A. Optimizing cellularization of whole decellularized heart extracellular matrix. PLoS One. 9 (2), e90406 (2014).
- Robertson, M. J., Soibam, B., O’Leary, J. G., Sampaio, L. C., Taylor, D. A. Cellularization of rat liver: An in vitro model for assessing human drug metabolism and liver biology. PLoS One. 13 (1), e0191892 (2018).
- Baghalishahi, M., et al. Cardiac extracellular matrix hydrogel together with or without inducer cocktail improves human adipose tissue-derived stem cells differentiation into cardiomyocyte-like cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. , (2018).
- Perea-Gil, I., et al. In vitro comparative study of two decellularization protocols in search of an optimal myocardial scaffold for recellularization. American Journal of Translational Research. 7 (3), 558-573 (2015).
- Freytes, D. O., O’Neill, J. D., Duan-Arnold, Y., Wrona, E. A., Vunjak-Novakovic, G. Natural cardiac extracellular matrix hydrogels for cultivation of human stem cell-derived cardiomyocytes. Methods Molecular Biology. 1181, 69-81 (2014).
- Oberwallner, B., et al. Preparation of cardiac extracellular matrix scaffolds by decellularization of human myocardium. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 102 (9), 3263-3272 (2014).
